现代分子细胞生物学实验ppt
- 1. 王金格福建农林大学现代分子细胞生物学实验 Modern Molecular Cell Biology Experiment 组员： 魏培宁 田淼崔慧慧 王金格 任课教师：郑祥梓
- 2. PPT模板下载：www.1ppt.com/moban/ 行业PPT模板：www.1ppt.com/hangye/ 节日PPT模板：www.1ppt.com/jieri/ PPT素材下载：www.1ppt.com/sucai/ PPT背景图片：www.1ppt.com/beijing/ PPT图表下载：www.1ppt.com/tubiao/ 优秀PPT下载：www.1ppt.com/xiazai/ PPT教程： www.1ppt.com/powerpoint/ Word教程： www.1ppt.com/word/ Excel教程：www.1ppt.com/excel/ 资料下载：www.1ppt.com/ziliao/ PPT课件下载：www.1ppt.com/kejian/ 范文下载：www.1ppt.com/fanwen/ 试卷下载：www.1ppt.com/shiti/ 教案下载：www.1ppt.com/jiaoan/ PPT论坛：www.1ppt.cn 目录CONTENTS前言背景1实验流程实验结果总结分析234
- 3. Foreword Background前言背景瞬时表达是一种快速的基因-蛋白质研究方法,通过在细胞内建立暂时高效的表达系统,获得目的基因或蛋白的短暂的高水平表达.与稳定表达相比,瞬时表达具有时间短,不需要整合到染色体上等优势,已经成为植物功能基因组研究的重要技术手段之一,在研究启动子活性、顺式作用元件的转录活性、转录调控蛋白功能等方面起着重要作用.基因枪转化是目前利用植物材料进行瞬时表达分析的主要转化技术。
- 4. 本实验以模式植物拟南芥的叶片为材料,以GFP荧光蛋白的活性作为监测指标,同时也利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成的融合蛋白），检测蛋白的表达量，以农杆菌作为一个工具将目的基因整合到烟草的细胞内 为优化拟南芥叶片基因枪转化系统,进而分析研究相关蛋白的功能提供理论参考。
- 5. Experiment process实验流程烟叶瞬时转化注入渗透用PEG处理拟南芥原生质体的瞬时转化拟南芥原生质体制备用荧光显微镜和CLSM检测转化用Bio-Rad PDS-1000 / He装置使用DNA-Goldparticle的生物聚合测定对植物细胞进行瞬时转化
- 6. 烟叶瞬时转化注入渗透1.挑取单克隆于5ml的含有抗生素的液体培养基中，28℃培养12~16h，颜色变为橙色测得OD600值1.8~2.0左右 2.离心4000rpm,10min ，集菌 3.加入Mgcl2 (清洗1次），再加Mgcl2 重悬，调节OD600值0.6~1.0 4.1000:1加入乙酰丁香酮（AS),在室温下，缓慢摇2~3h 5.取3周左右的烟草，用针管进行注射 6.是整片叶子充满注射液，叶子背面做好标记 7.温室培养3~4天，进行观察步骤：
- 7. 烟叶瞬时转化注入渗透
- 8. 拟南芥原生质体制备材料准备 使用5周龄的拟南芥叶片酶解、过滤 在室温下（20-22°C在空调房间内）在黑暗中（黑布覆盖）继续酶解，静置至少3小时（3-4h最佳）。用漏斗通过尼龙网（100μm目尺寸）过滤悬浮液到12ml细胞培养管中，之后把管放在冰上滤液处理 在200g（4℃）下离心原生质体悬浮液1分钟，去上清液原生质体重悬将W5加入细胞培养管中，轻轻翻转管重悬置于冰上静置40分钟材料处理 选择扩展良好的叶子（编号1,2,3），用透明胶带撕去叶片下表皮，然后浸入酶液。
- 9. MMG重悬 原生质体沉淀后除去上清液，并重新悬浮在计算体积的MMG溶液中，在室温（20-22℃）下具有2×10 5 pp / ml的浓度。颠倒轻轻混合。W5第二次清洗 从原生质体沉淀后取出上清液，用2ml W5再次清洗。冰上再放置40分钟试验创新点拟南芥原生质体原生质体显微镜计数 吸取10-12ul原生质体于血球计数板上用显微镜进行计数。
- 10. PEG介导的DNA转化为原生质体t混合质粒 将150ul原生质体,15ul质粒GOX-G，轻轻振荡混匀。同样操作，另外取15ul质粒GFP作为对照加PEG溶液，孵育 再向管中加入165ul体积的PEG溶液，并通过倒置管轻轻混合。一次做1-2个管，室温（20-22°C）开盖静置（孵育）5分钟。W5停止转换 添加4倍体积的W5停止转换过程。轻轻倒转管混合。200 g（4°C）离心1 min，去除上清液。加W1，过夜孵育 加入200ul体积的WI，轻轻颠倒管混合。水平放置试管并在室温（20-22°C）黑暗中孵育5-6小时。显微镜观察转化结果 孵育过后重旋一下，吸12ul于载玻片上进行显微镜观察转化结果。
- 11. 基因枪瞬时转化植物细胞 基因枪技术, 又被称为生物弹道技术或微粒轰击技术,是用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨(它们比重大, 而且化学性质都很稳定)颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织。
- 12. 基因枪瞬时转化植物细胞 以洋葱内表皮为材料，用刀片切取洋葱表皮并用镊子小心剥取内表皮(大小约为2×2cm)，刀片和镊子均经过70%乙醇消毒，以防止污染。剥取洋葱表皮于高渗培养基上（1%MS培养基上）。 取出质粒溶解后置于冰上。 2金粉-DNA样品的制备 取装有20uL金粉的1.5mLEP置于冰上用手轻轻弹，不能粘在壁上。 向金粉中加入总量为5ug的质粒，涡旋2min,使充分混匀。加入氯化钙（2.5 M）：50 µL和 亚精胺（0.1 M）：20µL用力甩到管底，涡旋2min左右使充分混匀。 离心2300g/min吸取上清液，余留10µL，枪头吸打或涡旋混匀。加入250uL无水乙醇，置于冰上备用。 1 实验材料准备
- 13. 基因枪瞬时转化植物细胞 破裂膜，载体膜，金属方定钮过滤网泡于75%乙醇中若干分钟。至于滤纸上吸干酒精。 样品重悬后剪枪头取10uL在载体膜中央晾干，放于金属旋钮里。 在DNA微弹组件中安装上终止屏，并将其固定在基因枪主体装置上； 含有洋葱表皮的培养基平板置于合适的射击距离处进行轰击； 将轰击后的培养基平板密封，室温暗培养36 h。 4，激光共聚焦显微镜下观察分析。 3，基因枪转化
- 14. western blot技术 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
- 15. 蛋白样品的制备ASDS聚丙烯凝胶电泳B转膜C封闭D一抗杂交 二抗杂交E底物显色Fwestern blot技术
- 16. 烟草注射实验结果荧 光 显 微 镜 像激 光 共 聚 焦 镜 像
- 17. 结果分析t从荧光显微镜观察结果可以确定转化成功，通过进一步得层扫可以初步确定22-G定位在细胞膜上。Result analysis t
- 18. 拟南芥原生质体转化实验结果 GFPCOX-G
- 19. 结果分析t拟南芥原生质体转化，对照组GFP初步认为定位在细胞膜。 COX-G的定位初步认定在线粒体上。
- 20. 基因枪瞬时转化植物细胞实验结果
- 21. 结果分析t原因分析： 洋葱表皮细胞老化；样品（金粉与质粒）没有混匀，只吸到了上清。 不同的实验材料、不同的轰击参数包括子弹的速度、轰击范围、轰击次数等都直接影响基因枪转化的效率 用基因枪转化洋葱表皮，转化失败。
- 22. Experimental results实验结果
- 23. 结果分析t因为前面的转化实验失败，所以本组没有样品做该实验。结果显示 为他组实验结果。Result analysis t原因分析：转化操作失败；
- 24. 课程总结tCOURSE SUMMARY1、做实验要做好充分的准备，比如器材，药品，试剂等。 2、做好实验记录，如标签、结果等。 3、多读文献，熟悉实验流程，原理。 4、实验结果失败认真分析总结。
- 25. 黑龙江八一农垦大学毕业答辩模板谢谢聆听
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