**科技学研究生学位文
(申请工程硕士专业学位)
兽疫链球菌ATCC 39920中透明质酸酶基hylBhylZ敲
THE KNOCKOUT OF HYALURONIDASE GENES HYLB AND HYLZ IN STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP ZOOEPIDIMICUS ATCC 39920
工程领域名称：生物工程
研 究 方 ： 基功研究
指 导 教 师： ** 教授
研究生 姓名： ***
申请学位类：工程硕士（全日制）
文提交日期：2013年5月
分类号：Q 学校代码：10057
密级：（秘密机密绝密） 研究生学号：10849906
兽疫链球菌ATCC 39920中透明质酸酶基hylBhylZ敲
The Knockout of Hyaluronidase Genes hylB and hylZ in Streptococcus Equi Subsp Zooepidimicus ATCC 39920
工程领域名称： 生物工程
研 究 方 ： 基功研究
指导教师姓名：** 教授
研究生姓名：***
申请学位类：工程硕士
文提交日期：2013年5月
文课题源：合作项目
学位授予单位：**科技学
天 津 科 技 学
学位文原创性声明
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知识产权专利权保护声明
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摘
透明质酸（Hyaluronic acidHA）种高分子聚合物葡萄糖醛酸βN乙酰氨基葡萄糖胺 β13 β14 糖苷键相连二糖单位重复构建成目前透明质酸生产逐渐动物组织提取法转微生物发酵法然现发酵采链球菌数产 HA产透明质酸酶成 HA 发酵产率低分子量潜素
目前Strepotococcus equi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中透明质酸酶相关研究少研究种菌中发现两透明质酸酶基：hylBhylZ两种酶蛋白序列进行结果显示两种透明质酸酶氨基酸完全两序列源性1066
基工程方法成功采基插入失活方法敲hylBhylZ两种透明质酸酶基获三种突变株：敲透明质酸酶基hylZ突变株ΔHylZ敲透明质酸酶基hylB突变株ΔHylB时敲hylBhylZ两基突变株ΔHylZB
三种突变株野生型 5L发酵罐中进行罐发酵检测基hylBhylZ敲否HA产量分子量乳酸产量蔗糖消耗速率细胞生长状况影响结果显示突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB较野生型WT透明质酸分子量差外透明质酸产量乳酸产量糖源利情况菌体生长情况均没明显差异HA产量达34gL细胞浓度波长660nm处吸光值达073乳酸产量达40gL糖源20h均消耗完全分子量突变株ΔHylBΔHylZBHA分子量较野生型WTΔHylZ 15达211×106Da发酵检测结果表明两种透明质酸酶基HA生产菌株Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920影响体现分子量HA生产进步研究两种酶基功具定理应价值
关键词：透明质酸酶基 兽疫链球菌 基敲 重组菌
ABSTRACT
Hyaluronic acid (Hyaluronate HA) is a linear polymer glycosaminoglycan polysaccharide composed of repeating disaccharide units of alternative β13 DNacetylglucosamine (GlcNAc) and β14 Dglucuronic acid At present the production of hyaluronic acid gradually extracted from the animal tissue changed to microbial fermentationsuch as Streptococcus However most existing fermentation of Streptococcus not only production HA also production of hyaluronic acid decomposing enzyme this may cause the the HA yield and molecular weight decreased
We got information that both production of hylZ and hylB gene were able to degrade HA but the amino acid sequence of the hyaluronidase HylZ and HylB were two different cmpletely the maximum homology have only 10
In this study we through a genetic engineering methods adopting the methods of insertion of a exogenous genes into the target genes and inactivated it successfully Three mutants were obtained the mutant ΔHylZ only knockout hyaluronicdase gene hylZ the mutant ΔHylB only knockout hyaluronicdase gene hylB and mutant ΔHylZB both hylZ and hylB genes were knockout
Three mutants ΔHylZ ΔHylB ΔHylZB and wildtype WT were fermented in a 5L jar to detect HA yield molecular weight lactic acid production sugar consumption rate and cell growth conditions Founding three mutants ΔHylZ ΔHylB ΔHylZB compared to the WT in addition to the differences in the molecular weight of the HA the HA yield production of lactic acid using of sugar growth of bacterial cells were no significant differences The production of HA can reach 34gL the cells OD660 can reach 073 lactic acid production can up to 40 gL sugar can be consumed completely at 20h But mutants ΔHylB and ΔHylZB the molecular size were higher than the wildtype WT and ΔHylZ about 7 reached 211×106 Da The fermentation test results showed that the two hyaluronidase genes was only influenced in the molecular weight in strain of Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920 it have some theoretical and application value on the further study of gene function of this two hyaluronidase
Key words Hyaluronidase geneSequi subsp Zooepidimicusgenen knockout
recombinant
目录
1 前言 1
11透明质酸简介 1
12透明质酸结构分布 1
13透明质酸性质途 3
131透明质酸性质 3
132 透明质酸途 4
14 透明质酸生产 6
141动物组织提取法 6
142微生物发酵法 6
15透明质酸酶简介 9
151 透明质酸酶分布 9
152 透明质酸酶性质 10
153 透明质酸酶途 11
154 链球菌透明质酸酶治病性关系 11
16文研究意义容 12
161课题研究意义 12
162课题研究容 12
2 材料方法 14
21 实验材料 14
211 菌种质粒 14
212 培养基 15
213 试剂 15
214 仪器 17
215 实验溶液 18
22 实验方法 19
221 菌种培养方法 19
222 琼脂糖凝胶电泳 19
223 兽疫链球菌基组DNA提取 20
224 胶回收DNA 20
225 DNA酶切连接 21
226 肠杆菌转化 21
23 透明质酸酶基hylB克隆 23
231透明质酸酶基hylB引物设计 23
232透明质酸酶基hylB克隆 24
24 透明质酸酶基hylZ克隆 25
241 透明质酸酶基hylZ引物设计 25
242 目片段hylZ 克隆 26
25 基敲载体构建 27
251 PCR 扩增氯霉素（cmr）抗性基 27
252 PCR 扩增卡霉素（kana）抗性基 28
253 基敲载体 pSET4Scmr pSET4Skana构建 29
26 兽疫链球菌转化突变株筛选 32
261兽疫链球菌感受态细胞制备 32
262兽疫链球菌感受态细胞电转化 32
263 突变株筛选 32
27 重组菌验证 33
271 PCR验证 33
272 抗性验证 34
28 罐摇瓶发酵检测方法 34
281 发酵条件 34
282 HA含量检测 34
283葡萄糖醛酸标曲制作 35
284 样品测定 35
285分子量测定 35
286 蔗糖浓度检测 36
287乳酸浓度测定 36
29 总RNA提取 36
3 结果讨 38
31 hylZhylB基核苷酸序列 38
32 兽疫链球菌总RNA提取 41
33 hylBhylZ基反转录 41
34兽疫链球菌总DNA提取 43
35透明质酸酶基hylB克隆 43
36透明质酸酶基hylZ克隆 45
37 基敲载体pSET4ScmrpSET4Skana构建 47
371基敲载体pSET4Scmr构建 47
372基敲载体pSET4Skana构建 49
38敲载体转化转化子验证 51
381 pSET4Scmr敲载体转化转化子验证 51
382 pSET4Skana敲载体转化转化子验证 53
383双敲转化验证 54
384阳性克隆抗性验证 55
39透明质酸酶基hylBhylZ菌株代谢影响 56
391生长曲线测定 57
392 HA产量测定 57
393 HA分子量测定 58
394 蔗糖测定 59
395 乳酸测定 59
4 结 61
5 展 62
6 参考文献 63
7 攻读硕士研究生学位期间发表文情况 69
8 致谢 70
1 前 言
11透明质酸简介
透明质酸(Hyaluronic acid简称 HA)名玻璃酸种高分子量独特线性分子粘糖广泛存生物体结缔组织中目前国际公认保湿剂[1]1934年Mayer[2]等动物眼玻璃体提取透明质酸(HA)外脐带皮肤关节滑液雄鸡冠等许软结缔组织中提取1937年Kendall[3]等链球菌菌株中提取透明质酸(HA)HA 生理作化学结构理化性质分布制备工艺医疗化妆品美容保健品方面应进行广泛深入研究[4]目前HA 应床诊断治疗化妆品食品保健品等方面[5]国 20 世纪 80年代开始领域研究取显著成果[611]
12透明质酸结构分布
透明质酸(HA) N乙酰葡萄糖胺葡萄糖醛酸通 β14 β13 糖苷键反复交连接成种高分子聚合物分子中二种单糖（βD葡萄糖醛酸 N乙酰基D氨基葡萄糖）等摩尔交互连接图11[12]般200025000种二糖单位均重复连接成分子量范围 20×10570×106Da[13]
D葡萄糖醛酸
N乙酰葡萄糖胺
图 11 透明质酸重复二糖单位结构
Fig 11 Structure of the disaccharide repeating unit of hyaluronic acid
电子显微镜观察证实 HA 线性单链[14] 图12水溶液中扩展成机线圈状线圈直径约 500nmHA 分子中双糖单位均含羧基生理条件均解离成负离子等空间距离负离子相互排斥分子水溶液中处松展状占量空间结合身 1000 倍水[15]着 HA 生物活性研究断深入发现粘弹性关节腔起润滑缓垫作结缔组织中充填料生物学功外HA 通作细胞细胞间质中 HA 受体调节细胞功组织生成修复肿瘤侵袭等程中发挥重作[16]HA 种活性认定 HA 二级结构甚三级结构存HA 空间呈刚性螺旋柱构型[17]柱侧含量羟基产生强烈亲水性图12
图12 电子显微镜HA结构
Fig 12 Electron micrograph of HA
图13透明质酸二级结构
Fig 13 Secondary structure of HA
透明质酸（Hyaluronic acidHA）种分布广泛粘糖广泛分布动物体结缔组织细胞外基质中[12]现结缔组织中脐带皮肤血清鸡冠关节滑液脑软骨眼玻璃体尿鸡胚兔卵细胞动脉静脉壁中分离透明质酸中鸡冠中含量高(7500 mgL)[18]哺乳动物体玻璃体脐带关节滑液中含量较高(4100 mgL)[15]HA 常蛋白质结合粘糖存玻璃体滑液中溶解形式存鸡冠脐带中凝胶形式存[19]透明质酸种天然生物聚合物仅动物体着重生理功时部分细菌中起着重作现已发现产 HA 细菌产气杆菌绿脓杆菌 ABC 溶血性链球菌[20]1937 年Kendall 等[3]发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 合成 HA 分泌胞外形成荚膜产生 HA 链球菌 A 族 C 族A 族中酿脓链球菌等致病性强较少作菌种进行规模发
酵C 族致病性较弱采类菌兽疫链球菌马疫链球菌类马疫链球菌等[21]链球菌外 Pasteurella multocida 产生 HA合成 HA 机制链球菌[22]动物组织提取菌种发酵生产 HA 种属差异化学质分子结构致相分子量[23]
13透明质酸性质途
131透明质酸性质
种源透明质酸均统命名透明质酸动物组织细菌源透明质酸种属差异类动物抗原性[24]透明质酸属生物分子分子链长度分子量均相分子质量范围2×1O57×106般达2×l06护左右双糖单位数30011000[25]水溶液旋光度70°80°[26]氯化钠溶液中葡萄糖醛酸中COOH 解离产生 H＋ HA 呈现酸性聚阴离子状态赋予 HA 酸性粘糖性质：呈白色定形固体臭味具强烈吸湿性溶水溶机溶剂[27]酸性粘糖相直链轴基团间氢键作HA 分子空间呈刚性双螺旋柱型[28]
水溶液中 HA 分子产生分子分子间相互作具特殊理化性质流变学特性数性等Laurent[29] 早机松展具定刚性线圈形容 HA 水中状态HA 水溶液突出物理性质高黏度结构决定[30]HA 具长线性分子链分子链等距离葡萄糖醛酸羧基带负电荷相互排斥分子链呈伸展状态倦缩成团较低浓度HA 分子间强烈相互作具高黏度时具润滑作[31]水溶液中图14[32]HA 分子链间形成疏松网状结构够结合保持量水具较强保水作
图14 HA水溶液中结构
Fig14 The structure of HA in water solution
HA 溶液具独特粘弹性剪切力黏度数值影响溶液受高剪切力作
时黏度降11000 溶液粘弹性着 HA 分子质量浓度增加增加认分子网络形成结果外酸性碱性条件透明质酸酶存条件紫外线臭氧超声波Co 射线温度某金属离子等素均 HA 发生降解[33]
132 透明质酸途
正独特理化性质HA体仅通分子网状结构粘弹性等发挥渗透压调节细胞连接物理屏障机械离缓等功够调节细胞功灭活基等生理活性胚胎形成肿瘤扩散伤口愈合抑制疼痛炎症反应中具重作[34]
1321 HA化妆品中应
HA 具良保湿作皮肤组织中广泛存天然分子优良性已受国际化妆品界广泛关注目前HA 化妆品类已初膏霜乳液化妆水精华素胶囊贴膜扩展浴液粉饼口红洗发护发剂摩丝等[35 36]研究表明体表皮真皮中含高浓度HA占体HA总量半皮肤中含水量HA含量直接相关着年龄增长皮肤老化认皮肤中HA含量降聚合度改变结果[37]含HA护肤品涂皮肤表面时HA形成层粘弹性水化膜维持加强角质层身吸水力屏障功促进皮肤护肤品中活性营养成分吸收防止皮肤干燥[38 39]
HA 阻止细胞中酶产生减少基形成防止基破坏细胞结构产生脂质氧化引起机体衰老等方面起着重作[40]低分子量HA 具抗炎抑制病菌产生保持皮肤光洁作细胞增殖分化提供合适场直接促进细胞生长分化重建修复[41 42]添加透明质酸化妆品已成国际日化界流产品许国家竞相研究开发取定进展日资生堂公司美国 Revlon 公司宝洁公司国永芳然美北京宝等品牌[43]
1322 HA保健食品中应
20世纪80年代末口服HA美容保健食品出现日基理：HA通口服消化吸收增加体HA合成前体皮肤组织中HA合成量增加皮肤饱水性增加富弹性皱纹减少[44]
体胚胎时期体 HA 含量高出生逐渐减少果 20 岁体 HA 相含量作 100305060 岁时分降 654525[45]相年龄群中含 HA 早老症患者 HA 含量较少显示衰老症状婴体 HA 含量成 20 倍左右显示出 HA 皮肤作[46]口服HA 保健品补充体 HA 缺失口服HA补充体HA足预防组织细胞老化特维持老年健康具特殊功[47]日国台湾均HA美容保健食品市现口服HA美容保健食品受越越
重视接受
1323 HA床医学中应
HA 构成关节软骨滑液成分滑液滑膜细胞吞噬细胞等合成[48 49]滑液中 HA 赋予滑液高度弹性润滑作具吸收应力减轻组织磨擦功HA蛋白形成复合物覆盖软骨表面形成薄定型结构层该结构具强变形性弹性起滑动层吸收应力作关节受力产生滑动时该结构先软骨表层破坏缓作发挥保护软骨维持软骨基质完整等功补充外源性高分子量 HA 治疗关疾病Balazs等先提出[50]认补充外源性 HA 病理状况滑液恢复正常状态重建润滑屏障保护功高粘弹性 HA 溶液代滑液关节提供应保护屏障功时病变关节创造然修复时间软骨然修复愈合外[51]高分子量 HA 抑制血组织增生抑制炎症反应屏蔽痛觉感受器明显缓解症状
HA现代眼科手术理想原料眼科手术中优良粘合剂润滑剂制成滴眼药玻璃体代品等[52]眼球晶体移植手术具较强粘度眼科粘性手术中理想唯效材料HA溶液具高度粘弹性术中注入前房效支撑前房时涂布眼组织表面手术器械表层形成保护膜避免器械损伤[15 53]HA眼组织保护作机理时方面仅局限机械缓垫作广泛应眼制剂中[15]HA身体天然存成分具生物相容性安全性
透明质酸床医学应外促进伤口愈合防粘连耳科疾病[54]血清中透明质酸检测[55]等床应中具重意义
14 透明质酸生产
141动物组织提取法
1934 年美国 Meyer Palmer 等首先牛眼玻璃体中分离出 HA 国外学者围绕 HA 性质生产开展量研究包括HA 生产工艺合成机制等[19 56 57]HA生产分两类动物组织原料提取法细菌发酵法
HA 存动物组织中分布广泛提取 HA 传统方法动物组织原料含量分子量考虑原料 HA 含量高低数量少易取程度等成素够生产原料鸡冠脐带动物眼球工艺程包括提取杂酶解沉淀分离组织 HA 提取纯化程定差[58 59]
动物组织提取法原料求较高原料必须新鲜采集冷冻处理动物原料组织价格昂贵源困难[60 61]动物原料组织中 HA 纯度低收率低提取程中消耗量机溶剂酶操作单元工艺复杂会
增加制备 HA 成该工艺原料源局限性产品提取率极低仅 1 左右工艺程序复杂生产成居高造成商品价格昂贵限制医药化妆品中广泛应宜进行工业化生产[62]雄鸡鸡冠中HA 蛋白糖结合分离高度纯化高分子量 HA 成更加昂贵更重：利动物源生化产品进行类治疗遇越越阻力产生病毒种间交叉感染风险性感染[63 64]源更受欢迎微生物发酵法开始逐渐代提取法生产 HA
142微生物发酵法
链球菌属种细菌 HA 成分荚膜图 15微生物发酵法利链球菌生长繁殖程中胞外分泌[65] HA 成分荚膜通分离纯化制备HA
图 15 链球菌荚膜示意图
Fig 15 Schematic program of capsule of streptococcus
HA 产生菌葡萄糖糖类作碳源蛋白胨酵母膏等氮源营养物质组成培养基特定条件培养发酵发酵结束滤精制菌体蛋白核酸机酸链球菌代谢生成复杂产物等杂质乙醇沉淀纯化等程序高纯度 HA 产品[66 67]
动物组织提取法相微生物发酵法具成低生产规模受动物原料限制发酵液中HA 游离状态存易分离纯化形成规模化工业生产动物源致病菌污染等优势[68]种源 HA 种属差异动物组织提取菌种发酵生产 HA化学质分子结构致相分子质量差[10]
1421 HA微生物合成途径
年研究[6973]确定 HA 合成需图 16 示途径合成 HA 两前体葡萄糖醛酸乙酰氨基葡萄糖葡萄糖种酶作分产生UDP葡萄糖醛酸 UDPN乙酰氨基葡萄糖 HA 合成酶(HasA)作合成 HA
图 16难出 HA 合成前体 1P葡萄糖UDP葡萄糖 UDPN乙酰氨基葡萄糖胺时合成细胞壁(约占细胞干重 20ww) HA 合成细胞生长间存着碳源竞争关系兽疫链球菌发酵生产 HA 重代谢特性[74 75]时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产途径)代谢产物乳酸乳酸细胞生长 HA 合成较强抑制作效转变细胞产途径降低乳酸细胞生长HA合成抑制作提高整发酵程生产强度生产效率具重意义[76]
图 16兽疫链球菌HA 生物合成途径
Fig 16 The biological synthesis pathway of HA in S zooepidemicus
1422 HA 合成分泌分子生物学机制
Dougherty Van de Rijn A 群链球菌研究发现 HA 前体合成 HA 合成需酶细胞膜关[77]透明质酸合成酶(hasA)链球菌中透明质酸合成操子中酶透明质酸合成关兽疫链球菌中操子中五基[78]：HA 合酶 (EC 241212 hasA) UDP葡萄糖脱氢酶(EC 11122 hasB) UDP葡萄糖焦磷酸化酶 (EC 2779 hasC) 具乙酰转移酶焦磷酸化酶活性双
功酶 (EC 2314EC 27723 hasD) 磷酸葡糖异构酶(EC 5319 hasE)
HA 前体简单酶作合成 HA真核原核微生物中形成原生质膜相关蛋白复合物催化 HA 合成运输[23 79 80]A 群链球菌 HA 分子链延长源 HA 非原端进行程 Mg2+存条件仅 UDP葡萄糖醛酸 UDPN乙酰葡萄糖胺底物合成 HA[81 82]合成时 UDPN乙酰葡萄糖胺 UDP葡萄糖醛酸交连接 HA 链反应进行非常快分钟约 100 糖单位
图 17 透明质酸合成酶合成分泌透明质酸程示意图[83]
Fig 17 Schematic program for the synthesis and secretion of HA by HA synthase
然目前 HA 长度控制机制尚结研究员提出三种机制[84]：(1) 透明质酸合成酶肽链存特定区域位点直接感应延伸中 HA 长度控制合成开始结束(2) 透明质酸合成酶 HA 亲力亲力决定延伸长度延伸中 HA 链环境受剪切力溶液布朗运动等产生合外力链长度呈正相关 HA 延伸定长度受外力合起透明质酸合成酶亲力时HA 释放催化反应停止 HA 透明质酸合成酶亲力高倾合成较长 HA反然(3) 透明质酸合成酶外检测 HA长度蛋白存产生信号转导透明质酸合成酶控制 HA 合成
15透明质酸酶简介
透明质酸酶（hyaluronicdaseHAase）透明质酸产生低分子化作酶总称透明质酸构成宿结缔组织细胞外基质成分根全国科学技术名词审定委员会公布生物化学名词hyaluronic acid译透明质酸药学名词药品国家标准称玻璃酸两者物质透明质酸酶称玻璃酸酶透明质酸酶透明质酸（HA）分子发生酶解子 HA 分子部
机切割 HA 分子产生 HA 分子片段降低 HA分子间相互作释放束缚水分子然降解 β13 糖苷键 β14 糖苷键酶作 HA 分子片段逐步 GlcA GlcNAc 降解
151 透明质酸酶分布
透明质酸酶分布动物细菌中否植物真菌中量含相关研究较少动物体血液尿液肝脏等组织均含透明质酸酶许微生物产生透明质酸酶革兰氏阴性菌产生酶胞质分泌保外环境中致病中酶更软骨素酶菌类产气单胞菌属弧菌属变形杆菌属梭形杆菌属脆弱类杆菌属产透明质酸酶革兰氏阳性菌链球菌属丙酸杆菌属葡萄球菌属拟杆菌属链霉菌属梭菌属等酿脓链球菌马链球菌温噬菌体产透明质酸酶细胞环境中未检测酶活性
152 透明质酸酶性质
根源结构作机制1952年Meyer等分三类[85]图18（1）切βN乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 32135）脊椎动物源动物毒液属类研究睾丸蜂毒溶酶体透明质酸酶类酶水解酶作β14糖苷键终产物四糖作软骨素硫酸软骨素转糖苷酶活性（2）细菌透明质酸酶（EC 4221）称透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase）种碱性糖蛋白该酶属切βN乙酰氨基葡萄糖苷酶源细菌通β消机制饱双糖催化透明质酸作软骨素硫酸软骨素（3）切β葡萄糖醛酸苷酶（EC 32136）类透明质酸酶源水蛭十二指肠虫作β13糖苷键降解产物四糖特异性降解HA降解软骨素硫酸软骨素
图18 透明质酸酶分类
Fig 18 The classification of hyaluronicdases
根适pH值脊椎动物源透明质酸酶分中性型酸性型两类：
适pH50左右中性型透明质酸酶睾丸微生物蛇昆虫毒素含透明质酸酶适pH3540左右酸性型透明质酸酶正常血清尿肝脏含透明质酸酶肿瘤组织中酸性型着分子技术发展根氨基酸序列源性透明质酸酶分原核生物透明质酸酶真核生物透明质酸酶两类
透明质酸酶具种特征菌株整生长期产生菌株特定生长期产生菌株透明质酸分解酶分泌发酵液中菌株原生质膜含菌株透明质酸分解酶数量活力[57]透明质酸分解酶活力低合成酶活力高菌株数具厚浓荚膜透明质酸酶特征认菌株生产 HA 力密切相关HA酶具稳定性长时间耐受 60℃机溶剂影响HA 生产中 HA 会酶分解提高 HA 产量发酵培养基中添加 HA 酶抑制剂藻酸硫酸盐（01 mgmL）减少 HA酶 HA 分子降解HA酶抑制剂会增加发酵液颜色 HA 分子紧密结合 HA 分离纯化工艺带麻烦影响 HA 回收率品质目前许透明质酸酶基克隆功确认
153 透明质酸酶途
透明质酸酶体暂时降低细胞间质粘性促皮输液局部积贮渗出液血液加快扩散利吸收种重药物扩散剂床作药物渗透剂促进药物吸收促进手术创伤局部水肿血肿消散缓慢速度进行静脉滴注药物种氨基酸水解蛋白等加快扩散利吸收透明质酸酶功细菌提供生长增殖必须碳源源透明质酸降解饱双糖原
154 链球菌透明质酸酶致病性关系
然链球菌属透明质酸酶致病机制致相均降解透明质酸降低细胞外基质粘度破坏宿物理防御屏障利细菌毒素扩散宿细胞暴露细菌种毒素中发病源透明质酸酶疾病发病程中作完全致
链球菌引起类疾病种化脓性炎症猩红热细菌性心膜炎新生败血症肾球炎风湿热等[25]目前已知引起链球菌相关疾病毒力子外毒素表面蛋白链球菌溶素透明质酸酶链激酶等相关酶类中透明质酸酶致病机制分解细胞外基质透明质酸病菌易组织中扩散名扩散子
乳链球菌属B族链球菌感染类牲畜重病原菌引起牛乳房炎危害畜牧业感染类引起败血症脑膜炎病死率极高尤新生目前该病菌致病机制尚未完全阐明相关报道[17]筛选出致病物质中包
括糖荚膜C蛋白溶血素透明质酸酶细胞外基质中检测产高水透明质酸酶致病株血清3型B族链球菌床研究证实该型菌株较型产较少透明质酸酶菌株毒力更说明细胞外基质透明质酸降解细菌入侵扩散程中起着极重作酿脓链球菌属A群链球菌生长早期形成荚膜起抗宿细胞吞噬作透明质酸构成荚膜成分着细菌进入数生长期透明质酸酶产生增荚膜逐渐减少研究[35]发现荚膜消失宿细胞吞噬细菌未明显增细菌吞噬子M蛋白抗吞噬作关然透明质酸酶酿脓链球菌毒力子体外细菌培养中检测透明质酸酶菌株超25引发令深思问题体外检测体否检测该酶存？酿脓链球菌透明质酸酶步研究方
16文研究意义容
161课题研究意义
课题研究兽疫链球菌中两种透明质酸酶基hylZhylB产透明质酸代谢产物影响透明质酸应医药化妆品保健食品中种重糖提高发酵生产 HA 产量拓展 HA 应范围探索 HA 特性应影响直国外研究热点细菌源透明质酸酶类够水解透明质酸产生分子饱双糖碱性蛋白酶类目前通基工程方法定透明质酸酶进行改造灭活研究少尤透明质酸生产代谢影响国没发现相关文献报道
162课题研究容
实验成功构建hylBhylZ两种透明质酸酶基敲载体成功通双交换两种基实现插入灭活图19具体容：
（1）实验室菌株兽疫链球菌ATCC39920NCBI数库中没获基组序列相关信息透明质酸酶相关基NCBI进行Blast搜索时发现ATCC35246MGCS10565hylBhylZ基具高相似性根ATCC35246相关序列进行相关引物设计
（2）PCR扩增克隆透明质酸酶基hylBhylZ
（3）助分子生物学方法构建透明质酸分解活力降低丧失菌株pSET4s作出发载体克隆PCR扩增透明质酸分解酶基片段连接pSET4s载体然透明质酸分解酶基片段中部选择合适酶切位点插入抗性基选择标记具体步骤图19
（4）构建成功敲载体分导入相应菌株中通源重组方法获目基失活菌株
（5）构建成功透明质酸酶基失活工程菌进行罐发酵检测两种基否菌株代谢产生影响
图19 敲载体构建策略
Fig 19 The strategies for construction of Knockout vector
2 材料方法
21 实验材料
211 菌种质粒引物
研究中菌种质粒表21列兽疫链球菌ATCC 39920购美国标准菌库肠杆菌相关质粒实验室保存
表21 研究菌种质粒
Table 21 Bacterial strains and plasmids used in this study
Strains or plasmids
Relevant characteristics
Sources
Strains
S zooepidemicus ATCC39920
Wildtype strain
ATCC
E coli JM109a
recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44
Gibco BRL
JM109pSET4skana
E coli JM109 harboring
pSET4skana
This work
S zooepidemicus
pSET4skana
S zooepidemicus harboring
pSET4skana
This work
JM109pSET4scmr
E coli JM109 harboring
pSET4scmr
This work
S Zooepidemicus
pSET4scmr
S zooepidemicus harboring
pSET4scmr
This work
S Zooepidemicus
pSET4scmr
S zooepidemicus harboring
pSET4scmr
This work
ΔHylZ
hylZ deletion mutant
kanar
This work
ΔHylB
hylB deletion mutant
cmr
This work
ΔHylZB
hylZ and hylB deletion mutant
kanarcmr
This work
Plasmids
PMD 18T
Tvector for routine cloning ampr
Takara
pSET 23b TrixB
Protein expression
This work
pSET1
provide the chloramphenicol promoter sequence
This work
pSET4s
E coliStreptococcus shuttle vector spcr
This work
pSET4shylZ
pSET4shylZ harboring the 5’ and 3’ flanking sequences of hylZ kanar
This work
pSET4shylB
pSET4sΔhylB harboring the 5’ and 3’ flanking sequences of hylB cmr
This work
212 培养基
(1) THB培养基：(1L)
牛肉浸粉 10 g
胰蛋白胨 20 g
葡萄糖 20g
碳酸氢钠 20g
氯化钠 20g
磷酸氢二钠 04g
加蒸馏水定容1L调PH78±02
(2) THB固体培养基：(1L)
THB培养基中加入15琼脂
(3) THY培养基：(1L)
牛肉浸粉 10 g
胰蛋白胨 20 g
葡萄糖 20g
碳酸氢钠 20g
氯化钠 20g
磷酸氢二钠 04g
酵母提取物 20g
加蒸馏水定容1L调PH78±02
(4)TSB培养基：(1L)
胰蛋白胨 17 g
豆蛋白胨 30g
葡萄糖 20g
磷酸氢二钾 04g
氯化钠 20g
加蒸馏水定容1L调PH72±01
(5) LB培养基：（1L）
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 50g
NaCl 10g
加蒸馏水定容1L
213 试剂
（1）工具酶
表22 文相关酶
Table 22 Relative enzymes used in the study
酶
生产厂商
Taq DNA聚合酶
Fermentas
KOD FX
东洋纺（海）生物科技限公司
BamH I
Fermentas
Pst I
Fermentas
DraⅢ
Fermentas
T4 DNA连接酶
Fermentas
（2）试剂盒Marker
表23 实验试剂盒
Table 23 Reagent Kit and Marker
产品
生产厂商
DNA凝胶电泳纯化回收试剂盒
北京索莱宝科技限公司
质粒提试剂盒
北京索莱宝科技限公司
1 kb DNA Ladder Marker
Fermentas
（3）化学试剂
表24 实验化学试剂
Table 24 Chemical reagents
试剂
等级
生产厂商
葡萄糖
分析纯
**市化学试剂厂
蔗糖
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯化钠
分析纯
**市四通化工厂
氢氧化钠
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
硝酸铵
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
浓盐酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
浓硫酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
冰乙酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
柠檬酸
色谱级
**市元立化工化学试剂厂
磷酸二氢钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
磷酸氢二钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
醋酸钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
七水硫酸镁
分析纯
**市四通化工厂
七水硫酸亚铁
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
二水氯化钙
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
MES
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
七水硫酸锌
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
四水氯化锰
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
六合水氯化钴
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
五水硫酸铜
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
二合水钼酸钠
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
硼酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
水硫酸锰
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯化钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
DMSO
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
异戊醇
分析纯
**市化学试剂三厂
异丙醇
分析纯
**市化学试剂三厂
Glycerol
分析纯
**市化学试剂三厂
乙二胺四乙酸
分析纯
**市化学试剂三厂
琼脂粉
生物级
北京索莱宝科技限公司
水乙醇
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯仿
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氢氧化钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
苯酚
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
Tris
超纯级
北京索莱宝科技限公司
琼脂糖
电泳级
美国OXOID公司
溴酚蓝
分析纯
海生物工程限公司
氨苄青霉素
生化级
美国Sigma公司
卡霉素
生化级
美国Sigma公司
链霉素
生化级
美国Sigma公司
潮霉素
生化级
美国Sigma公司
胰蛋白胨
生化级
美国OXOID公司
酪蛋白胨
生化级
美国OXOID公司
酵母提取物
生化级
美国OXOID公司
214 仪器
表24 实验仪器
Table 24 Instrument used in the study
仪器
生产厂商
基脉导入仪
美国BIORAD公司
凝胶成仪
美国BIORAD公司
PTC200型PCR仪
eppendorf
pH计
梅特勒托利仪器海公司
AB204S型分析天
梅特勒托利仪器海公司
移液器
eppendorf
DYYIII2型稳压稳流电泳仪
北京六仪器厂
DYCZ24D型电泳槽
北京六仪器厂
TGL16C台式离心机
海安亭科技仪器厂
高速冷冻离心机GL20A
日日立限公司
HG753电热恒温培养箱
**实验仪器厂
ZHWY211B控温摇床
海志诚设备厂
SCDII型高纯水装置
军事医学科学院卫生装备研究
SS325型全动灭菌锅
日TOMY仪器限公司
SHAB水浴恒温振荡器
江苏国华仪器厂
紫外分光光度计
北京普析通仪器责限公司
215 实验溶液
2151 葡糖醛酸含量测定溶液
（1）硼砂硫酸液
称取四硼酸钠477g溶浓硫酸(AR)500mL中
（2）咔唑试液
称取咔唑0125g溶乙醇(AR)100mL中置棕色瓶中冰箱保存
（3）提取缓液：NaCl 100 mmolLEDTA 50 mmolLTrisHCl 50 mmolL pH 85SDS 1
（4）1 molL TrisHCl
称取12114 g Tris加水1 LHCl调pH80121 ℃灭菌15 min
（5）电泳缓液（50×TAE）
Tris 242g冰乙酸 571 mL05 molL EDTA（pH 80）100 mL加水定容1 L121 ℃灭菌15 min室温保存备
（6）500 mmolL 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH80）
800 mL 双蒸水中加入 186 g 乙二铵四乙酸二钠充分溶解 10
molLNaOH 溶液调 pH 80双蒸水定容 1000 mL121℃高压灭菌 15 min备
（7）TE 缓液（pH80）
1 molL TrisHCl（pH80）10 mL 500 mmolL EDTA（pH80）溶液 2 mL双蒸水定容 1000 mL121℃高压灭菌 15 min备
（8）10 SDS
10 g 高纯度 SDS 置烧杯中加入约 80 mL ddH2O68℃加热溶解滴加盐酸调节 pH 值 72定容 100 mL 室温保存
22 实验方法
221菌种培养方法
(1)肠杆菌培养
肠杆菌培养均 LB 培养基中37℃培养 24 h需加入抗生素时氨苄青霉素终浓度 100 μgmL氯霉素 10 μgmL
(2)兽疫链球菌培养
保存80℃甘油中兽疫链球菌取出接种 10 mL 液体培养基中37℃200 rpm 振荡培养夜菌液稀释涂布固体THB板37℃培养 24 h形成明显单菌落
挑取单菌落接种装 10 mL 液体培养基试中摇床200 rmin 培养14 h～16 h培养温度设37℃然8接种量述培养液接入盛50 mL液体培养基三角瓶中振荡培养 14 h
222 琼脂糖凝胶电泳
（1）称取定量琼脂糖（1）加入1×TAE微波炉中加热琼脂糖完全溶解分离效果见表25
表25 琼脂糖凝胶线性分离范围
Table 25 Separating scope of agarose gel
Agarose concentration（）
Separate scope（kb）
03
560
06
120
07
0810
09
057
12
046
15
023
（2）溶液冷60 ℃时加入溴化乙锭终浓度05 μgmL
（3）琼脂糖倒入制胶模具中迅速模具端插梳子
（4）琼脂糖溶液完全凝固心取出梳子凝胶置电泳槽中
（5）电泳槽中加入电泳缓液高胶面1 mm
（6）电泳样品中加入6×溴酚蓝样缓液混匀加入样品孔中
（7）接通电源电压特殊求般120 V
（8）根溴酚蓝指示剂迁移位置断定否终止电泳
（9）电泳完毕取出凝胶检测电泳结果
（10）DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收
223 兽疫链球菌基组DNA提取
（1）兽疫链球菌活化接种30ml THY培养基中200rpm 37℃夜培养取20ml菌液12000rpm离心10min收集菌体
（2）加入4ml01SDS 37℃ 200rpm 处理30min取1ml 12000rpm 离心5min弃清加入500ulTE蔗糖溶液重悬加入终浓度10mgml 溶菌酶37℃处理1h加入浓度20mgml蛋白酶K 55℃温育3h
（3）80℃灭活蛋白酶K
（4）加入终浓度25mol醋酸铵冰浴20min
（5）12000rpm 离心20min转移清05ml新2mlEP中
（6）加入2倍体积冰冷水乙醇沉淀10min 12000rpm离心10min1ml 75乙醇洗涤12000rp离心5min弃清
（7）室温晾干加入70ul菌水TE缓液溶解20℃冻存
224 胶回收DNA
（1）单目 DNA 条带琼脂糖凝胶中切（量切余部分）放入干净离心中称取重量
（2）胶块中加入 3 倍体积溶胶液（果凝胶重 01g体积视 100µl加入300µl 溶胶液） 5055℃水浴放置 10 分钟间断温翻转离心确保胶块充分溶解
注意：溶胶时果溶胶液变红色（正常情况淡黄色）含 DNA胶溶液中加 10–30µl 3M 醋酸钠（pH52）溶胶液调淡黄色否会影响 DNA 吸附柱结合影响回收效果
（3）步溶液加入吸附柱中（吸附柱放入收集中）13000rpm 离心 3060秒倒掉收集 中废液吸附柱重新放入收集中
注意：胶块完全溶解胶溶液温度降室温柱吸附柱较高温度时结合 DNA 力较弱
（4）吸附柱中加入 700μl 漂洗液（前请先检查否已加入水乙醇）13000rpm离心 3060 秒倒掉废液吸附柱重新放入收集中
（5）吸附柱中加入 500μl 漂洗液13000rpm 离心 3060 秒倒掉废液
（6）12000 rmin离心2 min敞口置室温段时间
（7）加入50 μL 65 ℃预热TE放置5 min12000 rmin离心2 min
（8）回收质粒置20 ℃
（9）冰放置分钟制成感受态细胞悬液
（10）感受态细胞分装成100 μL份贮存70 ℃保存
225 DNA酶切连接
实验中 DNA 限制性切酶反应限制性切酶说明进行载体 DNA 限制性切酶消化琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒回收纯化目片段连接反应DNA 片段连接反应参连接酶说明 10 μL 反应体系中加入 2μL 连接反应缓液l μL T4 DNA 连接酶载体 DNA(100 ng)外源 DNA 摩尔 131516℃连接夜连接产物全部转化肠杆菌感受态细胞
226 肠杆菌转化
2251肠杆菌感受态细胞制备
（1）保藏80℃肠杆菌划线新鲜 LB 板37℃培养 12 h～16 h单菌落清晰
（2）挑取单菌落接种含3ml LB 培养液10ml试中培养约 12 h
（3）取 2ml 夜培养菌液接种装 100mL LB培养基500ml三角瓶中37℃ 200rpm振荡培养23h(时肠杆菌生长处数期中期OD6000506细胞数约47×107ml1)
（4）装菌液三角瓶置冰冰浴 1030min4℃ 5000 rpm 离心10 min
（5）倾清加 20 mL 预冷 01 molL Mgcl2混匀冰放置 10 min
（6）4℃ 5000 rpm 离心 10min倾清
（7）加入 25 mL 预冷 01 molL Cacl2混匀冰放置 20 min
（8）4℃ 5000 rpm 离心 10min倾清
（9）加入 5 mLCacl2（01 molL） 1 mL 甘油
（10）分装已灭菌 EP 中 100 μL转化80℃保存备
2252肠杆菌感受态细胞转化
（1）80℃冰箱中取出肠杆菌感受态置冰融化
（2） 10 μL 混合体系（载体目基）加入 100 μL 肠杆菌感受态中混匀冰浴30 min
（3）42℃热激 90 s然冰浴 2 min
（4）加入 900 μL LB 液体培养基37℃摇床（200 rpm）培养 45min
（5）5000 rpm 离心 3 min弃清
（6）加入 200 μL LB 液体培养基菌液分涂布相应抗性LB 固体板
（7）固体板置培养箱中37℃倒置培养 12 h～14 h
2253肠杆菌阳性克隆筛选验证
实验采敲策略目基部插入抗性基图21发生源重组透明质酸基断目蛋白失活筛选时般含抗生素固体板长出单菌落阳性克隆单菌落需进步验证板挑取单菌落 3mL LB 液体培养基(含抗生素)中37℃振荡培养 12 h～14 h取菌液进行 PCR然 1琼脂糖凝胶电泳选择扩增出目基菌株 1接种量接种20 mL LB液体培养基(含抗生素)中37℃振荡培养12 h～14 h少量提取质粒电泳检验质粒 DNA 提取情况立进行双酶切进步验证外源片断否插入酶切反应体系提供限制性切酶说明书进行 10 μL 反应体系中加入 2 μL 酶切反应缓液切酶 l μL质粒 4 μL～6 μL37℃恒温酶切 2 h～4 h 电泳检查酶切结果
（a）
（b）
（c）
图 21 基敲策略双交换模型
Fig 21 Strategies of gene knockout and doubleexchange model
(a) 敲策略采插入破环法图酶切位点(b) 双交换模型
(c)成功发生双交换抗性基整合目标基中部目基失活
2254 肠杆菌质粒提取
(1) 取 3 mL 夜培养肠杆菌菌液12000 rpm 离心 2 min弃清
(2) 250 μL Solution I 充分悬浮细菌沉淀
(3) 加入 250 μL SolutionⅡ轻轻翻转 5～6 次菌液充分裂解形成透明溶液
(4) 加入 400 μL SolutionⅢ 轻轻翻转 5～6 次直形成紧实凝集块然室温放置 2 min
(5) 室温 12000 rpm 离心 10 min取清
(6) 试剂盒中 Spin Column 安置 Collection Tube
(7) 述操作 5 清液转移 Spin Column 中12000 rpm 离心 1 min弃滤液
(8) 500 μL RinseA 加入 Spin Column 中12000 rpm 离心 30 s弃滤液
(9) 700 μL RinseB 加入 Spin Column 中12000 rpm 离心 30 s弃滤液
(10) 重复操作 9
(11) Spin Column 安置新 15 mL 离心 Spin Column 膜：中央加入 40 μL加热 60℃ Elution Buffer室温静置 1 min
(12) 12000 rpm 离心 1 min 洗脱 DNA
(13) 取 4 μL 洗脱液电泳
23 透明质酸酶基hylB克隆
231透明质酸酶基hylB引物设计
根Genbank中公布ATCC 35246透明质酸酶基序列引物设计序列：
UPhylB：GTCACTGCAGGTAGCTATGG AATCCAGTCTTG（划线PstI酶切位点）
DWhylB：CAGTGGATCCGCCCACGACTCATATCCATGAG（划线BamHI酶切位点）
232透明质酸酶基hylB克隆
(1) 基组DNA模板UPhylBDWhylB引物进行PCR扩增反应体系
表26 20μL PCR反应体系
Table 26 20 uL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约16 kbDNA片段
（3） 切酶PstI BamHI胶回收目片段克隆载体pSET4s进行双酶切
表27 20μL DNA片段酶切体系
Table 27 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
hylB 基片段
5μL
pSET4s载体
2μL
1×K Buffer
2μL
1×K Buffer
2μL
PstI
1μL
PstI
1μL
BamHI
1μL
BamHI
1μL
dd H2O
10μL
dd H2O
14μL
反应条件：述体系37℃反应夜酶切产物进行纯化回收参考2243
（4） 目片段 pSET4s 载体双酶切纯化产物连接
表28 20μL DNA片段连接体系
Table 28 20μL DNA fragments ligated system
名称
体积
pSET4s 载体酶切产物
1μL
hylB基酶切产物
5μL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer
1μL
T4 DNA 连接酶
1μL
ddH2O
4μL
反应条件：述体系16℃反应夜
（5） 10 μL 连接体系转化肠杆菌感受态助氯霉素（10 μgmL）抗性筛选菌落PCR 验证选择阳性转化子进行培养
（6）少量提取质粒PstIBamHI 质粒进行双酶切验证200 μL反应中建立
表29 重组质粒酶切体系
Table 29 recombinant plasmid digestion system
名称
体积
重组质粒
6μL
PstI
1μL
BamHI I
1μL
1×K Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37℃作2 h电泳检测
(7) PCR质粒提取酶切等鉴定确定含重组质粒肠杆菌转化子培养OD600 04～08送华基公司进行测序
24 透明质酸酶基hylZ克隆
241透明质酸酶基hylZ引物设计
根Genbank中公布MGCS 10565透明质酸酶基hylZ序列引物设计序列：
引物序列：
UPhylZ： GTGAGGATCCCCTGATGTAG CACCTCCCCACC（划线BamHI酶切位点）
DWhylZ：GAGTCTGCAGGACGGCGTCT TGTCAGCTTCCT（划线PstI酶切位点）
242 目片段hylZ 克隆
（1） 基组DNA模板UPhylZ DWhylZ引物进行PCR扩增
表210 20μL PCR反应体系
Table 210 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约16 kbDNA片段
（3） 切酶PstI BamHI胶回收目片段克隆载体pSET4s进行双酶切
表211 20μL DNA片段酶切体系
Table 211 20μL DNA fragments digestion system
名称
体积
名称
体积
hylZ 基片段
5μL
pSET4s载体
2μL
1×K Buffer
2μL
1×K Buffer
2μL
PstI
1μL
PstI
1μL
BamHI
1μL
BamHI
1μL
dd H2O
10μL
dd H2O
14μL
（4） 目片段 pSET4s 载体双酶切纯化产物连接
表212 20μL连接体系
Table 212 20μL ligation system
名称
体积
pSET4s 载体酶切产物
1μL
hylZ基酶切产物
5μL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer
1μL
T4 DNA 连接酶
1μL
ddH2O
4μL
述溶液混合均匀16℃夜连接
（5） 10 μL 连接体系转化肠杆菌感受态助卡霉素（100 μgmL）抗性筛选菌落 PCR 验证选择阳性转化子进行培养
（6） 少量提取质粒PstIBamHI 质粒进行双酶切验证200 μL反应中建立
表213 20μL重组质粒酶切体系
Table 213 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
重组质粒
6μL
PstI
1μL
BamHI I
1μL
1×K Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37℃作2 h电泳检测
（7） PCR质粒提取酶切等鉴定确定含重组质粒肠杆菌转化子培养OD600 04～08送华基公司进行测序
25 基敲载体构建
251 PCR 扩增氯霉素（cmr）抗性基
（1）根质粒氯霉素（cmr）抗性基序列引引物[86]PCR扩增氯霉素（cmr）抗性基完整阅读框引物序列：
CMUP：CATGCACTTTGTGTAATTCGATGGGTTCCGAGG（划线DraIII酶切位点）
CMDW：CATGCACAAAGTGCACCGAACTAGAGCTTGATG（划线DraIII酶切位点）
表214 20μL PCR反应体系
Table 214 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约10 kbDNA片段
252 PCR 扩增卡霉素（kana）抗性基
（1）根质粒卡霉素（kana）抗性基序列引引物[61]PCR扩增卡霉素（kana）抗性基完整阅读框引物序列：
KANAF：GTGACACAATGTGTCCCCTGGATACCGCTCG（划线DraIII酶切位点）
KANAR：GAGTCACATTGTGGAACCCCAGAGTCCCGC（划线DraIII酶切位点）
表215 20μL PCR反应体系
Table 215 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约10 kbDNA片段
253 基敲载体 pSET4Scmr pSET4Skana构建
2531基敲载体 pSET4Scmr
（1）切酶DraIII已连接hylB目基pSET4S质粒pSET4ShylB氯霉素（cmr）抗性基进行单酶切磷酸化处理
表216 20μL DNA片段酶切体系
Table 216 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
质粒 pSET4ShylB
2μL
氯霉素抗性基
10μL
DraIII
1μL
DraIII
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
dd H2O
15μL
dd H2O
6μL
（2）酶切纯化产物13摩尔混匀加入T4连接酶4℃连接夜
（3）连接产物转化肠杆菌筛选抗氯霉素（cmr）转化子UPhylB DWhylB引物组合转化子进行菌落PCR验证PCR验证体系程序：
表217 20μL PCR反应体系
Table 217 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（4）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
（5）PCR产物1琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选获26kb条带转化子进行培养
（6）提取质粒命名pSET4Scmr切酶DraIII 质粒进行酶切验证 酶切体系：
表218 20μL重组质粒酶切体系
Table 218 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
质粒pSET4Scmr
5μL
DraIII
1μL
10×FastDigest Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37 ℃作2 h电泳检测
（7）酶切验证阳性质粒基敲载体pSET4Scmr
2532基敲载体 pSET4Skana
（1）切酶DraIII已连接hylZ目基pSET4S质粒pSET4ShylZ卡霉素（kana）抗性基进行单酶切磷酸化处理
表219 20μL DNA片段酶切体系
Table 219 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
质粒pSET4ShylZ
2μL
卡霉素抗性基
10μL
DraIII
1μL
DraIII
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
dd H2O
15μL
dd H2O
6μL
（2）酶切纯化产物13摩尔混匀加入T4连接酶4℃连接夜
（3）连接产物转化肠杆菌筛选抗卡霉素（kana）转化子UPhylZ DWhylZ引物组合转化子进行菌落PCR验证PCR验证体系程序：
表220 20μL PCR反应体系
Table 220 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
菌超纯水补足总体积 50 μL
（4）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
（5）PCR产物1琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选获26kb条带转化子进行培养
（6）提取质粒命名pSET4Scmr切酶DraIII 质粒进行酶切验证 酶切体系：
表221 20μL重组质粒酶切体系
Table 221 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
质粒pSET4Skana
5μL
DraIII
1μL
10×FastDigest Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37 ℃作2 h电泳检测
（7）酶切验证阳性质粒基敲载体pSET4Skana
26 兽疫链球菌转化突变株筛选
261兽疫链球菌感受态细胞制备[13]
（1）80℃保藏甘油中接入THY液体培养基中37℃ 200rpm 活化24h稀释105106倍涂布THB板37℃培养24h
（2）挑取单菌落接入THY液体培养基中37℃ 200rpm培养培养1214h
（3）1接种新鲜100mlTHY液体培养基中37℃200rpm培养OD530约037加入海生工生产透明质酸酶125ku继续培养30min培养结束时OD530约058
（4）培养结束冰浴10min停止生长
（5）灭菌50ml离心12000rpm 4℃离心10min
（6）清加入冰冷05M蔗糖溶溶液液20ml重悬菌体
（7）12000rpm 4℃离心10min
（8）弃清5ml冰冷05M蔗糖溶液重悬菌体
（9）12000rpm 4℃度离心10min
（10）弃清加入500μL含15甘油05M蔗糖溶液重悬菌体 50μL等体积分装菌15mLEP中立电转者放入80℃冰箱中冻存
262兽疫链球菌感受态细胞电转化
（1）取4ul质粒加入50ul感受态中混匀
（2）转移2mm遇冷电转杯中25kv20025uF电击（果1mm电转杯电压设置1517kv）
（3）电击立加入复苏液THY培养基转移EP中
（4）30℃复苏34h
（5）12000rpm离心2min集菌
（6）清剩余100200ul涂布相应抗性板
（7）28℃培养4876h
（8）挑取转化子进行单双抗二次验证
（9）筛选克隆接种CmR抗性THY液体培养基中37℃ 200rpm培养12h次划线CmRSpcRCmR抗性板验证Spc敏感性
263 突变株筛选
（1）挑取验证转化子30℃相应抗性THY培养基中培养活化
（2）1接种传代普通THY培养基中（含抗性）30℃培养12h
（3）次1接种传代普通THY培养基中（含抗性）40℃培养6~8h
（4）稀释适倍数（约10）涂布相应抗性板
（5）挑取步中获单克隆分点接单抗双抗板
（6）选取单抗生长双抗生长克隆次点接双抗板进行次验证
（7）验证正确提取基组进行PCR验证
（8）重复（3）（7）步骤直挑选出突变株
图 22 突变株筛选流程
Fig 22 Mutants screening process
27 重组菌验证
图23示成功发生双交换抗性基会插入目基中部功丧失目基游设计验证引物进行PCR验证时原目基10kb时会菌株具相应抗生素抗性
271 PCR验证
筛选出合适转化子提取基组验证引物p1p2进行PCR验证发生双交换目条带26kb未发生双交换目条带16kb进步验证否发生双交换引物p1p4p2p3进行PCR验证中p3p4抗性基引物发生双交换会出现相应目条带
图 23 双交换示意图
Fig 23 The doublecrossover diagram
272 抗性验证
正图23示发生双交换质粒丢失菌株会具相应抗生素抗性时菌株点接相应抗性板会正常生长野生型会种方更进步验证突变株
28 罐摇瓶发酵检测方法
281 发酵条件
5L发酵罐中进行发酵发酵培养基蔗糖50gL酪蛋白胨10gL酵母提取物35gLK2HPO4 2gLNaCl 15gLMgSO4·7H2O 04gL发酵条件：5L发酵液装液量3L接种量837℃pH70通气量3vvm发酵22h5MNaOH调节pH
282 HA含量检测
（1）样品预处理
4h6h样品取2ml等体积01SDS处理 10min8h22h样品取1ml1ml离子水稀释然2ml01SDS处理 10min1200rpm离心15min
取1ml清3倍体积水乙醇沉淀30min1200rpm离心10min清转移新10ml离心测定乳酸蔗糖沉淀2ml水乙醇洗涤遍
1200rpm离心10min弃清室温晾干4h样品4ml菌水溶解6h8h样品8ml菌水溶解10h22h样品10ml菌水溶解ＨＡ含量测定
283葡萄糖醛酸标曲制作
（1）精密称取葡萄糖醛酸20mg置100mL量瓶中加水溶解刻度摇匀备
（2）精密量取标准溶液05115225mL分加入10mL量瓶中加水稀释刻度1020304050ugmL浓度品溶液
（3）取6具刻度试分加入硼砂硫酸液5mL置冰浴中冷4℃左右（4）分取空白溶液(纯化水)浓度品溶液1mL加入试中先轻轻振摇充分混匀断冰浴冷
（5）试置沸水中加热10min置水中冷室温
（6）加入咔唑试剂02mL混匀水浴中加热15min冷室温
（7）530nm处测定吸光度A吸光度浓度c作图绘出标准曲线
284 样品测定
取样品溶液1mL标准曲线测定方法测定530nm吸光度标准曲线查出应葡萄糖醛酸浓度稀释倍数葡萄糖醛酸含量占整产量4643测葡萄糖醛酸含量4643HA产量
285分子量测定
取适量时发酵液等体积01SDS处理10min12000rmin离心15min取清3倍体积水乙醇沉淀30min12000rmin离心10min清沉淀乙醇盐溶液洗涤次室温晾干适量02MNaCl溶液溶解充分溶解045μm滤膜滤滤乌氏粘度计测出特性粘度改良咔唑法测出HA含量根公式计算出HA分子量具体步骤：
（1）测定出02M氯化钠溶液流出乌氏粘度计流出时间t0t0应167mim
（2）测定出时处理样品流出乌氏粘度计流出时间t1t1应介t01315倍间
（3）测定出时间样品HA含量c
（4）根公式计算出特性粘度η根特性粘度计算出分子量Mη公式式21：
式 21
286 蔗糖浓度检测
吸取测样品溶液09 mL(蔗糖含量应40250 mgL)01mL 2molL氢氧化钠然100℃沸水浴中加热10 min立流水中冷加入间苯二酚溶液1 mL 10molL盐酸3 mL摇匀置80℃水浴中加热8 min冷500 nm波长处空白调零测定样品吸光度标准样作求样品中蔗糖含量
287乳酸浓度测定
乳酸含量测定程中发酵时间样品稀释倍数相4h需稀释50倍6h24h稀释100倍测定时样品HA含量测定时沉淀HA时乙醇清液稀释倍数沉淀HA算起样品倍数稀释充分混匀采SBA40型生物传感分析仪（山东省科学院生物研究）测定乳酸产量次进样25μL乳酸产量公式22
式 22
29 总RNA提取
（1）液体培养基中生长菌体离心收集迅速放入液氮预冷研钵中次研磨粉末
（2）取50~100mg菌体放入预冷RNase污染离心中（121℃灭菌1h）迅速加入1ml Trizol试剂移液器吹匀漩涡振荡器振荡2min室温放置5min12000rpm 4℃离心10min
（3）移取清新离心中加入200μl酚200μl氯仿抽提充分剧烈混匀室温放置3min12000rpm 4℃离心15min
（4）移取清新离心中加入100μl酚100μl氯仿抽提充分剧烈混匀室温放置3min12000rpm 4℃离心15min（程重复次中间层）
（5）移取清新离心中加入200μl氯仿抽提充分剧烈混匀12000rpm 4℃离心10min
（6）移取清新离心中加入等体积异戊醇2倍体积水乙醇20℃70℃沉淀30min12000rpm 4℃离心10min
（7）弃清加入1ml 75乙醇洗涤两次（12000rpm 4℃离心2min）室温干燥加入适体积（50μl）DEPC水溶解70℃冻存甲酰胺溶解RNA沉淀贮存20℃（注意：RNA完全干燥否会降低溶解度）
（8）预先灭菌15琼脂糖凝胶加热凝固制胶放清水水乙醇处理晾干电泳槽中加入灭菌电泳液
（9）取2μl RNA置灭菌离心中计入RNA专loading buffer 2μl电泳30min
3 结果讨
31 hylZhylB氨基酸序列
Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中发现两种透明质酸酶基hylZhylBNBCI里接入号分 CP002904NC_011134核苷酸序列源性3585 hylZ基1695碱基中594碱基基hylB相(594bp1657bp)相 hylZ基1695碱基编码564氨基酸基hylB3192碱基前体基真正起作部分第604碱基开始编码869氨基酸残基
图31中出两种酶氨基酸序列源性1066两透明质酸酶氨基酸两完全相序列
图31 hylBhylZ氨基酸序列
Fig 31 Alignments of the amino acid sequence of hylB with ylZ
32 兽疫链球菌总RNA提取
进步研究hylBhylZ基否表达否活性两种透明质酸酶基链球菌身里RNA转录水进行研究首先兽疫链球菌中总RNA进行提取图32野生型兽疫链球菌中总RNA提取电泳图（a）（b）分清楚总RNA样品中DNA污染前电泳图出总RNA提取成功克隆肠杆菌Ecoli B L21中进行表达纯化通测定两种酶活性（数未列出）结果显示兽疫链球菌中透明质酸酶基hylZ肠杆菌Ecoli B L21克隆表达纯化未检测出活性种透明质酸酶基hylB克隆表达纯化降解HA活性高
图32 兽疫链球菌中总RNA提取
Fig 32 The total RNA extraction from Sequi subsp zooepidimicus ATCC 39920
（a）清DNA前总RNA电泳图12分两行样
（b）清DNA总RNA电泳图12分两行样
33 hylBhylZ基反转录
提取总RNA进行反转录前避免RNA中DNA污染影响反转录结果准确性首先DNA进行清验证否清干净反转录参三磷酸甘油醛脱氢酶引物：GAPDHF：TGCTTTCCGTCGTATCCAGAPDHR：CACCGTCAGTAGCCCAGT 进行验证图33a泳道12两组样品阴性泳道3阳性样品1样品2中泳道46分清DNA前PCR结果泳道57清DNAPCR验证结果PCR验证结果中出结总RNA样品1中DNA污染样品2中没清DNA均排DNA污染
(a)
(b)
图 33 hylBhylZ基反转录结果
Fig 33 The reverse transcription results of hylB and hylZ
（a）RNA样品中DNA污染清验证
12：两组样品阴性 3：阳性 46：清DNA前PCR结果
57：清DNAPCR验证结果
（b）：三磷酸甘油醛脱氢酶基RTPCR结果 hylB：透明质酸酶基hylB RTPCR结果hylZ：透明质酸酶基hylZ RTPCR结果
清DNA污染总RNA样品作反转录模板反转录试剂盒操作手册进行反转录获cDNAcDNA模板分引物GAPDHF：TGCTTTCCGTCGTATCCAGAPDHR：CACCGTCAGTAGC CCA GTHylZF：GGATCT GATCCAGCTTGCCAAGGAA HylZR ：CAGCAGG AATAGCC TC TG ATAACTC HylBF ：TTATCAGATTGCAGCGGAGTCCAGC HylBR：CAG GTAGCTGT CATATGAGACGATTG 进行PCR扩增反应程序：预变性4min变性30s退火1min延伸30s延伸5min35循环PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图33bRTPCR结果显示基hylZRNA转录水较高相反基hylB转录水低
34兽疫链球菌总DNA提取
研究根GeneBank中公布兽疫链球菌ATCC 35246透明质酸酶基序列进行目基PCR扩增基础设计PCR扩增引物培养收集足够兽疫链球菌菌体提取总DNAPCR方法扩增目基
图34 兽疫链球菌总DNA提取
Fig 34 Total DNA extracted from Streptococcus zoopidemics
兽疫链球菌菌体包裹着丰富粘糖物质菌液粘稠收集菌体时需发酵液稀释长时间离心提取DNA时需加入溶菌酶提取总DNA1琼脂糖凝胶电泳检测结果图34示图出提取DNA基完整杂质较少明显降解现象基PCR扩增
35透明质酸酶基hylB克隆
（1）hylB基片段PCR扩增
兽疫链球菌总DNA模板UPhylBDWhylB引物进行PCR扩增扩增产物1琼脂糖凝胶电泳结果图35示
图 35 PCR 扩增 hylB 基片段
Fig 35 Amplification gene of hylB by PCR
M：DNA marker 1：基hylB PCR 扩增产物
透明质酸酶基HylB总约25kb左右研究中采插入灭活基方法需左右源臂长度800bp左右设计引物扩增目条带1686bp图35中约16kb条清晰条带实验预期结果1686bp相符条带切胶回收步实验
（2）HylB基片段胶回收
采 TaKaRa Agarose Gel DNA purification kit hylB 基 PCR 产物进行回收纯化回收纯化电泳结果 PCR 扩增目基产物电泳结果
（3）hylB基PCR产物pSET4S载体酶切连接转化
获 hylB 基片段 pSET4S 载体分进行Pst IBamH I 双酶切酶切产物回收加入 T4 连接酶16℃夜连接然转化肠杆菌感受态助壮观霉素抗性筛选阳性克隆子
（4利菌落PCR检测肠杆菌转化子
壮观霉素抗性板挑取单菌落进行菌落PCR扩增电泳结果显示检测肠杆菌转化子16kb左右出现亮条带扩增出片段吻合结果图36初步证明hylB基片段连接pSET4S 载体
图 36转化子菌落 PCR 结果
Fig 36 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker12：转化子菌落 PCR 验证
（5） 重组质粒酶切验证
选择PCR验证阳性转化子进行培养提取质粒质粒切酶Pst IBamH I 双酶切进行重组质粒验证理应4605 bp1686 bp条带图37中出验证结果理致说明目片段已连pSET4S载体结果图37
图 37重组质粒酶切验证
Fig 37 Digested verification of recombinant plasmid
M：DNA marker12 质粒BamHⅠPstⅠ酶切条带
36透明质酸酶基hylZ克隆
（1）兽疫链球菌总DNA模板UPhylZDWhylZ引物进行PCR扩增扩增产物1琼脂糖凝胶电泳结果图38示
图 38 PCR 扩增 hylZ 基片段
Fig 38 Amplification of hylZ by PCR
M：DNA marker 1：hylZ 基 PCR 扩增产物
图38中约16 kb条清晰条带实验预期结果1600 bp符步连接转化
（2）hylZ基片段胶回收
采 TaKaRa Agarose Gel DNA purification kit hylZ 基 PCR 产物进行回收纯化回收纯化电泳结果 PCR 扩增目基产物电泳结果
（3）hylZ基PCR产物批pSET4S载体酶切连接转化
获 hylZ基片段 pSET4S 载体分进行Pst IBamH I 双酶切酶
切产物回收加入 T4 连接酶16℃夜连接然转化肠杆菌感受态助壮观霉素抗性筛选阳性克隆子
（4） 利菌落PCR检测肠杆菌转化子
图39转化子菌落 PCR 结果
Fig 39 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 验证
(5) 重组质粒酶切验证
选择PCR验证阳性转化子进行培养提取质粒质粒切酶Pst IBamH I双酶切进行重组质粒验证结果图310酶切结果验证正确步实验
图 310重组质粒酶切验证
Fig 310 Digested verification of recombinant plasmid
M：DNA marker12 质粒BamHⅠPstⅠ酶切条带
37 基敲载体pSET4ScmrpSET4Skana构建
371基敲载体pSET4Scmr构建
（1）氯霉素抗性基PCR扩增
根质粒氯霉素（cmr）抗性基序列引引物CMUP CMDWPCR扩增氯霉素（cmr）抗性基完整阅读框
图311 PCR扩增氯霉素基
Fig 311 Amplification of chloroamphenicol gene by PCR
M：DNA marker1~3：氯霉素基 PCR 产物
切胶回收目片段
（2）氯霉素基连接转化
切酶DraⅢ单酶切已连接hylB基pSET4S质粒磷酸化处理加入T4连接酶16℃连接夜混合体系转化肠杆菌感受态助氯霉素抗性筛选阳性克隆子
（3）利菌落PCR检测肠杆菌转化子
UPhylBDWhylB引物组合进行PCR扩增理应该约27 kb条带图312结果预期致验证正确步实验
图312转化子菌落 PCR 结果
Fig 312 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 产物
（4） 重组质粒提取酶切验证
选择扩增27 kb片段转化子进行培养采肠杆菌质粒提取方法PCR检测阳性肠杆菌阳性转化子进行质粒提取电泳检测图313示质粒提取Pst IBamH I 酶切进行重组质粒鉴定结果图313示
（a） （b）
图 313重组质粒 pSET4Scmr 提取酶切验证
Fig 313 The detection and digested verification of recombinant plasmid in Ecoli
（a）重组质粒 pSET4ScmrM： DNA ladder marker1~2：重组质粒 pSET4Scmr
（b）重组质粒 pSET4Scmr酶切验证M：DNA marker 1：BamHI Pst I酶切验证结果
电泳图313知提取质粒分子量72 kb左右利Pst IBamH I 酶切重组质粒通电泳凝胶检测26 kb左右出现见电泳条带扩增出片段相符合表明氯霉素抗性基已成功插入载体位目基中部证明基敲载pSET4Scmr构建成功
372基敲载体pSET4Skana构建
（1）卡霉素抗性基PCR扩增
根质粒卡霉素（kana）抗性基序列引引物KANAFKANARPCR扩增卡霉素（kana）抗性基完整阅读框图314
图314 PCR扩增卡霉素基
Fig314 Amplification of kanamycin gene by PCR
M：DNA marker1~3：卡霉素基 PCR 产物
切胶回收目片段
（2）卡霉素基连接转化
切酶DraⅢ单酶切已连接hylB基pSET4S质粒磷酸化处理加入T4连接酶16℃连接夜混合体系转化肠杆菌感受态助卡霉素抗性筛选阳性克隆子
（5）利菌落PCR检测肠杆菌转化子
UPhylZDWhylZ引物组合进行PCR扩增理应该约28 kb条带图315结果预期致
图315转化子菌落 PCR 结果
Fig 315 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 产物
（6） 重组质粒提取酶切验证
选择扩增27 kb片段转化子进行培养采肠杆菌质粒提取方法PCR检测阳性肠杆菌阳性转化子进行质粒提取电泳检测图316（a）示质粒提取Pst IBamH I 酶切进行重组质粒鉴定结果图316（b）
（a） （b）
图 316重组质粒 pSET4Skana 提取酶切验证
Fig316 The detection and digested verification of recombinants plasmid in Ecoli
（a）重组质粒 pSET4Skana 提取M： DNA ladder marker12：重组质粒 pSET4Skana （b）酶切验证M：DNA marker 12：BamHI Pst I酶切验证结果
图316知提取质粒分子量72 kb左右利Pst IBamH I 酶切重组质粒通电泳凝胶检测
27kb左右出现见电泳条带扩增出片段相符合表明氯霉素抗性基已成功插入载体位目基中间表明基敲载pSET4Skana构建成功
38敲载体转化转化子验证
381 pSET4Scmr敲载体转化转化子验证
野生型兽疫链球菌ATCC 39920敲载体pSET4Scmr混匀电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图317
图317 pSET4Scmr载体电转转化子
Fig317 The transformat of pSET4Scmr vecter
兽疫链球菌革兰氏阳性菌株带较厚荚膜菌落形态图317示圆润透明
挑取定量转化子点接cmrspcr双抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选出cmr单抗板生长cmrspcr双抗性板生长单克隆提取基组进行PCR验证终六株阳性克隆140克隆中10株阳性克隆双交换概率约7
图 318 突变株PCR验证示意图
Fig 318 PCR validation diagram of mutants
发生双交换引物组p1p2p1p4p2p3进行验证分会出现2746bp 2171 bp 2130bp条带图319P1引物序列GCGGTTGGTTGATG ACCTGACGP2引物学列CAATCGGCAAATCAAAGTGGTGP3引物序列 GTGACACAATGTGTCCCCTGGATACCGCTCGP4引物序列GAGTCACATTG TGGAACCCCAGAGTCCCGC
（a） （b）
图319阳性克隆PCR验证
Fig319 The identification of positive transformants by PCR
（a）引物组p1p2验证M：DNA marker1：WT2~3：阳性克隆
（b）引物组p1p4p2p3验证M：DNA marker1：p1p42：p2p3
电泳图出引物组p1p2p1p4p2p3分阳性克隆PCR验证时结果预期相符初步判断获需转化子进步验证转化子正确性获突变株画线接种形影抗性板观察生长情况
382 pSET4Skana敲载体转化转化子验证
野生型兽疫链球菌ATCC39920敲载体pSET4Skana电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图320
图320 pSET4Skana载体电转转化子
Fig320 The transformats of pSET4Skana vecter
挑取定量转化子点接cmrspcr双抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选120克隆中获6株cmr单抗性板生长cmrspcr双抗性板生长菌株6株菌接种带cmr抗性THY培养基中培养提取基组验引物进行PCR验证验证结果图321
图321验证引物组p1p2阳性克隆PCR验证
Fig321 The identification of positive transformants by primer p1p2
M：DNA marker1：阴性2：WT4~8：阳性克隆
示意图示发生双交换时基组左臂更左约200bp右臂更右约200bp位置设计验证引物组进行PCR验证时会出现34kb左右条带野生型没外源抗性基插入会原基组应约27kb
图321结果出阳性克隆PCR克隆条带结果理相符初步判断获索突变株
更进步验证阳性转化子正确性选插入透明质酸酶基中部抗性基引物p3p4验证引物p1p2进行组合PCR方法更准确确认双交换发生PCR验证结果图322
图322 验证引物组p1p4p2p3阳性克隆PCR验证
Fig 322 The identification of positive transformants by primer p1p4p2p3
M：DNA marker13：引物组p1p424：引物组p2p3
图315示发生双交换时引物组合p1p4p2p3PCR扩会约23kb21kb条带图322出目条带理致进步证明阳性转化子正确性
383双敲转化验证
双敲转化子已敲透明质酸酶基hylZ基础hylB基进行敲敲载体pSET4Scmr已敲hylZ突变菌株ΔHylZ混匀电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图323
图323 pSET4Scmr载体电转转化子
Fig323 The transformat of pSET4Scmr vecter
挑取定量转化子点接cmrspcr三种抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选50克隆中获3株cmr单抗性板生长cmrspcr双抗性板生长菌株5株菌接种带cmr抗性THY培养基中培养提取基组验证引物进行PCR验证验证结果：
图324验证引物组p1p2阳性克隆PCR验证
Fig 324 The identification of positive transformant by PCR
M：DNA marker1：WT2~4：双敲阳性克隆
验证引物p1p2野生型WT够扩增出22kb条带发生双交换突变株够扩增出33kb条带图324结果证明成功获突变株
384阳性克隆抗性验证
进步验证转化子正确性观察突变株野生型相否形态变化获三种突变株野生型抗性THY固体培养基进行进行画线培养图322出突变株形态没明显改变突变株带抗性基抗性培养基会表现出生长状态图325示
带抗性培养基野生型WT三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB会生长（图 325a）kana抗性培养基突变株ΔHylZΔHylZB会生长野生型WT突变株ΔHylB会生长（图 325b）样cmr抗性板WTΔHylZ会生长ΔHylBΔHylZB会生长（图 325c）kanacmr双抗行板双敲菌株ΔHylZB够正常生长（图 325d）实验结果相符进步证明突变株正确性
图325阳性转化子抗性验证抗
Fig 325 The resistance verification of positive transformants
（a）抗性THY固体培养基 （b）kana抗性THY固体培养基
（c）cmr抗性THY固体培养基 （d）kanacmr双抗性THY固体培养基
39 透明质酸酶基hylBhylZ菌株代谢影响
透明质酸合成高耗程定灭活相关透明质酸酶基理会菌株代谢产物产生影响文通5L发酵罐中采发酵培养基控制发酵条件温度37℃pH值70通气量3vvm搅拌转速300rmin发酵22h
测定生长曲线HAHA分子量蔗糖乳酸等相关代谢产物否确定透明质酸酶基代谢影响
391生长曲线测定
5L发酵罐中进行发酵时产生丰富HA时菌体会量繁殖致发酵液非常粘稠法直接测定660nm吸光值必须发酵液进行稀释具体方法准确吸取1mL发酵液试中移液准确量取9mL菌水加入试中稀释十倍充分混匀660nm测定吸光值测定结果图326示生长曲线中出曲线基呈S型前4h处停滞期4h10h进入数生长期期间明显观察菌体迅速繁殖代谢产物剧烈增加6h时发酵液已变粘稠10h发酵液相已粘稠进入稳定期野生型三种突变株生长状况基相没显著差异
图326 兽疫链球菌WT三种突变株生长曲线
Fig 326 The growth curves of WT and its mutants
392 HA产量测定
HA产量测定方法采改良咔唑法理讲果两种透明质酸酶hylBhylZ基兽疫链球菌ATCC 39920表达活性话基进行灭活成功时会体现出HA产量提高测定结果图327出突变株野生型HA产量基相没明显差原导致：①两种酶基未表达②两种酶基表达兽疫链球菌里没活性③两种酶基表达表达量低粘稠发酵液中起作微微
图327兽疫链球菌WT三种突变株HA产量
Fig 327 The HA production of WT and its mutants
393 HA分子量测定
文通测定特性粘度方法测定透明质酸分子量分子量处理溶液浓度乌氏粘度计流出时间关浓度越流出时间更长时分子量越样原理两透明质酸酶基hylBhylZ基表达活性时理HA分子量会增图328出野生株WT突变株ΔHylZ发酵产生HA分子量基相似突变株ΔHylB双敲突变株ΔHylZB发酵产生HA分子量基相似前两种菌株WT突变株ΔHylZ8h相差时野生株WT产HA分子量191×106双敲菌株ΔHylZB产HA分子量211×106高出15
图328兽疫链球菌WT三种突变株HA分子量
Fig 328 The HA MW of WT and its mutants
394 蔗糖测定
兽疫链球菌发酵产HA高耗程糖类提供量源文发酵程中采蔗糖作碳源测定消耗程定程度反映野生菌株突变株代谢方面否差图329发现糖原利方面然突变株ΔHylBΔHylZB耗糖速度突变株ΔHylZ野生型ΔWT快差距明显利糖趋势基相进入数期蔗糖含量急剧降发酵20h蔗糖已基倍消耗干净值发酵22h便停止发酵原
图329糖消耗程曲线图
Fig 329 Kinetics of sugar comsuption in fermentation process
395 乳酸测定
HA 合成前体 1P葡萄糖UDP葡萄糖 UDPN乙酰氨基葡萄糖胺时合成细胞壁(约占细胞干重 20ww) HA 合成细胞生长间存着碳源竞争关系兽疫链球菌发酵生产 HA 重代谢特性时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产途径)代谢产物乳酸乳酸细胞生长 HA 合成较强抑制作效转变细胞产途径降低乳酸细胞生长HA合成抑制作提高整发酵程生产强度生产效率具重意义
兽疫链球菌产透明质酸高耗程合成1mol HA需3mol ATP图16乳酸产生成菌株量代谢程密切相关测定三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT乳酸产量定程度反映出两种透明质酸酶基定插入灭活否量代谢产生影响图330出
三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT乳酸产量方面没差说明两种透明质酸酶基量代谢程没影响
图330产乳酸程曲线图
Fig 330 Kinetics oflactic acid in fermentation process
4 结
实验成功Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中两种透明质酸酶基hylBhylZ进行基敲初步研究两种基失活HA产量分子量相关代谢产物代谢影响Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920发酵生产HA 具定理实际应意义
（1）Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中发现两种够降解HA透明质酸酶基hylBhylZ序列显示两种完全透明质酸酶
（2）提取Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920总RNA进行RTPCR反转录实验结果显示两种透明质酸酶基会表达基hylB转录水低基hylZ转录水高
（3）成功获三种突变菌株：敲透明质酸酶基hylZ突变株ΔHylZ敲透明质酸酶基hylB突变株ΔHylB时敲hylBhylZ两基突变株ΔHylZB
（4）三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT菌株进行罐发酵检测结果显示突变株野生型菌体生长HA产量糖原消耗速率乳酸产量均没明显差异说明透明质酸酶基hylZhylB四方面没显著影响分子量突变株ΔHylBΔHylZB相突变株ΔHylZ野生型WT15
（5）两种透明质酸酶基HA分子量较影响发酵条件酶作条件适条件两种酶基转录差异两种酶表达否具透明质酸酶活性造成两种酶活性进步研究
5 展
年细菌性源透明质酸酶研究越越类酶基结构降解机制生化性质应领域等更深刻认识时步研究应提供方应该许方面需进步研究予证实透明质酸降解方细菌源透明质酸酶适反应条件酶活性检测方法探索改进等相信着研究记忆深入类基时代透明质酸酶特性越越发现时透明质酸身研究应进步促进作预防治疗透明质酸酶相关疾病提供新途径理
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7 攻读硕士研究生学位期间发表文情况
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[2] 王洋洋王震希宏刘浩．三株药乳杆菌生理生化特征研究[J]．安徽农业科学201341(8)：33103313
8 致 谢
三年研究生生活渐入尾声三年中发生令难忘怀事谨关心帮助表示衷心感谢
文导师刘浩教授悉心指导完成刘老师广博专业知识精益求精工作作风严谨治学态度获益匪浅接受全新思想观念树立远学术目标领会基研究方法课题选题实验方案设计实验进行直文撰写程中刘老师热心帮助力支持整实验进行中困难重重刘老师次予耐心指导精辟意见精神备受鼓舞够克服困难继续前行刘老师表示衷感谢
两年学科研中时感谢希宏老师张健老师研究生期间予亲切指导帮助真诚感谢实验室杨进李孙芳等私帮助外11级研究生12级研究生试验完成予少协助表示衷心感谢
衷心感谢物质精神始终支持家朋友表示诚挚谢意
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(申请工程硕士专业学位)
兽疫链球菌ATCC 39920中透明质酸酶基hylBhylZ敲
THE KNOCKOUT OF HYALURONIDASE GENES HYLB AND HYLZ IN STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP ZOOEPIDIMICUS ATCC 39920
工程领域名称：生物工程
研 究 方 ： 基功研究
指 导 教 师： ** 教授
研究生 姓名： ***
申请学位类：工程硕士（全日制）
文提交日期：2013年5月
分类号：Q 学校代码：10057
密级：（秘密机密绝密） 研究生学号：10849906
兽疫链球菌ATCC 39920中透明质酸酶基hylBhylZ敲
The Knockout of Hyaluronidase Genes hylB and hylZ in Streptococcus Equi Subsp Zooepidimicus ATCC 39920
工程领域名称： 生物工程
研 究 方 ： 基功研究
指导教师姓名：** 教授
研究生姓名：***
申请学位类：工程硕士
文提交日期：2013年5月
文课题源：合作项目
学位授予单位：**科技学
天 津 科 技 学
学位文原创性声明
郑重声明：呈交文导师指导独立进行研究工作取成果文中特加标注引容外文包括集体已发表撰写成果容包括获**科技学教育机构学位证书材料文研究做出重贡献集体均已文中明确方式标明完全意识声明法律果承担
作者签名：
日期： 年 月 日
知识产权专利权保护声明
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作者签名： 日期： 年 月 日
导师签名： 日期： 年 月 日
摘
透明质酸（Hyaluronic acidHA）种高分子聚合物葡萄糖醛酸βN乙酰氨基葡萄糖胺 β13 β14 糖苷键相连二糖单位重复构建成目前透明质酸生产逐渐动物组织提取法转微生物发酵法然现发酵采链球菌数产 HA产透明质酸酶成 HA 发酵产率低分子量潜素
目前Strepotococcus equi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中透明质酸酶相关研究少研究种菌中发现两透明质酸酶基：hylBhylZ两种酶蛋白序列进行结果显示两种透明质酸酶氨基酸完全两序列源性1066
基工程方法成功采基插入失活方法敲hylBhylZ两种透明质酸酶基获三种突变株：敲透明质酸酶基hylZ突变株ΔHylZ敲透明质酸酶基hylB突变株ΔHylB时敲hylBhylZ两基突变株ΔHylZB
三种突变株野生型 5L发酵罐中进行罐发酵检测基hylBhylZ敲否HA产量分子量乳酸产量蔗糖消耗速率细胞生长状况影响结果显示突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB较野生型WT透明质酸分子量差外透明质酸产量乳酸产量糖源利情况菌体生长情况均没明显差异HA产量达34gL细胞浓度波长660nm处吸光值达073乳酸产量达40gL糖源20h均消耗完全分子量突变株ΔHylBΔHylZBHA分子量较野生型WTΔHylZ 15达211×106Da发酵检测结果表明两种透明质酸酶基HA生产菌株Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920影响体现分子量HA生产进步研究两种酶基功具定理应价值
关键词：透明质酸酶基 兽疫链球菌 基敲 重组菌
ABSTRACT
Hyaluronic acid (Hyaluronate HA) is a linear polymer glycosaminoglycan polysaccharide composed of repeating disaccharide units of alternative β13 DNacetylglucosamine (GlcNAc) and β14 Dglucuronic acid At present the production of hyaluronic acid gradually extracted from the animal tissue changed to microbial fermentationsuch as Streptococcus However most existing fermentation of Streptococcus not only production HA also production of hyaluronic acid decomposing enzyme this may cause the the HA yield and molecular weight decreased
We got information that both production of hylZ and hylB gene were able to degrade HA but the amino acid sequence of the hyaluronidase HylZ and HylB were two different cmpletely the maximum homology have only 10
In this study we through a genetic engineering methods adopting the methods of insertion of a exogenous genes into the target genes and inactivated it successfully Three mutants were obtained the mutant ΔHylZ only knockout hyaluronicdase gene hylZ the mutant ΔHylB only knockout hyaluronicdase gene hylB and mutant ΔHylZB both hylZ and hylB genes were knockout
Three mutants ΔHylZ ΔHylB ΔHylZB and wildtype WT were fermented in a 5L jar to detect HA yield molecular weight lactic acid production sugar consumption rate and cell growth conditions Founding three mutants ΔHylZ ΔHylB ΔHylZB compared to the WT in addition to the differences in the molecular weight of the HA the HA yield production of lactic acid using of sugar growth of bacterial cells were no significant differences The production of HA can reach 34gL the cells OD660 can reach 073 lactic acid production can up to 40 gL sugar can be consumed completely at 20h But mutants ΔHylB and ΔHylZB the molecular size were higher than the wildtype WT and ΔHylZ about 7 reached 211×106 Da The fermentation test results showed that the two hyaluronidase genes was only influenced in the molecular weight in strain of Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920 it have some theoretical and application value on the further study of gene function of this two hyaluronidase
Key words Hyaluronidase geneSequi subsp Zooepidimicusgenen knockout
recombinant
目录
1 前言 1
11透明质酸简介 1
12透明质酸结构分布 1
13透明质酸性质途 3
131透明质酸性质 3
132 透明质酸途 4
14 透明质酸生产 6
141动物组织提取法 6
142微生物发酵法 6
15透明质酸酶简介 9
151 透明质酸酶分布 9
152 透明质酸酶性质 10
153 透明质酸酶途 11
154 链球菌透明质酸酶治病性关系 11
16文研究意义容 12
161课题研究意义 12
162课题研究容 12
2 材料方法 14
21 实验材料 14
211 菌种质粒 14
212 培养基 15
213 试剂 15
214 仪器 17
215 实验溶液 18
22 实验方法 19
221 菌种培养方法 19
222 琼脂糖凝胶电泳 19
223 兽疫链球菌基组DNA提取 20
224 胶回收DNA 20
225 DNA酶切连接 21
226 肠杆菌转化 21
23 透明质酸酶基hylB克隆 23
231透明质酸酶基hylB引物设计 23
232透明质酸酶基hylB克隆 24
24 透明质酸酶基hylZ克隆 25
241 透明质酸酶基hylZ引物设计 25
242 目片段hylZ 克隆 26
25 基敲载体构建 27
251 PCR 扩增氯霉素（cmr）抗性基 27
252 PCR 扩增卡霉素（kana）抗性基 28
253 基敲载体 pSET4Scmr pSET4Skana构建 29
26 兽疫链球菌转化突变株筛选 32
261兽疫链球菌感受态细胞制备 32
262兽疫链球菌感受态细胞电转化 32
263 突变株筛选 32
27 重组菌验证 33
271 PCR验证 33
272 抗性验证 34
28 罐摇瓶发酵检测方法 34
281 发酵条件 34
282 HA含量检测 34
283葡萄糖醛酸标曲制作 35
284 样品测定 35
285分子量测定 35
286 蔗糖浓度检测 36
287乳酸浓度测定 36
29 总RNA提取 36
3 结果讨 38
31 hylZhylB基核苷酸序列 38
32 兽疫链球菌总RNA提取 41
33 hylBhylZ基反转录 41
34兽疫链球菌总DNA提取 43
35透明质酸酶基hylB克隆 43
36透明质酸酶基hylZ克隆 45
37 基敲载体pSET4ScmrpSET4Skana构建 47
371基敲载体pSET4Scmr构建 47
372基敲载体pSET4Skana构建 49
38敲载体转化转化子验证 51
381 pSET4Scmr敲载体转化转化子验证 51
382 pSET4Skana敲载体转化转化子验证 53
383双敲转化验证 54
384阳性克隆抗性验证 55
39透明质酸酶基hylBhylZ菌株代谢影响 56
391生长曲线测定 57
392 HA产量测定 57
393 HA分子量测定 58
394 蔗糖测定 59
395 乳酸测定 59
4 结 61
5 展 62
6 参考文献 63
7 攻读硕士研究生学位期间发表文情况 69
8 致谢 70
1 前 言
11透明质酸简介
透明质酸(Hyaluronic acid简称 HA)名玻璃酸种高分子量独特线性分子粘糖广泛存生物体结缔组织中目前国际公认保湿剂[1]1934年Mayer[2]等动物眼玻璃体提取透明质酸(HA)外脐带皮肤关节滑液雄鸡冠等许软结缔组织中提取1937年Kendall[3]等链球菌菌株中提取透明质酸(HA)HA 生理作化学结构理化性质分布制备工艺医疗化妆品美容保健品方面应进行广泛深入研究[4]目前HA 应床诊断治疗化妆品食品保健品等方面[5]国 20 世纪 80年代开始领域研究取显著成果[611]
12透明质酸结构分布
透明质酸(HA) N乙酰葡萄糖胺葡萄糖醛酸通 β14 β13 糖苷键反复交连接成种高分子聚合物分子中二种单糖（βD葡萄糖醛酸 N乙酰基D氨基葡萄糖）等摩尔交互连接图11[12]般200025000种二糖单位均重复连接成分子量范围 20×10570×106Da[13]
D葡萄糖醛酸
N乙酰葡萄糖胺
图 11 透明质酸重复二糖单位结构
Fig 11 Structure of the disaccharide repeating unit of hyaluronic acid
电子显微镜观察证实 HA 线性单链[14] 图12水溶液中扩展成机线圈状线圈直径约 500nmHA 分子中双糖单位均含羧基生理条件均解离成负离子等空间距离负离子相互排斥分子水溶液中处松展状占量空间结合身 1000 倍水[15]着 HA 生物活性研究断深入发现粘弹性关节腔起润滑缓垫作结缔组织中充填料生物学功外HA 通作细胞细胞间质中 HA 受体调节细胞功组织生成修复肿瘤侵袭等程中发挥重作[16]HA 种活性认定 HA 二级结构甚三级结构存HA 空间呈刚性螺旋柱构型[17]柱侧含量羟基产生强烈亲水性图12
图12 电子显微镜HA结构
Fig 12 Electron micrograph of HA
图13透明质酸二级结构
Fig 13 Secondary structure of HA
透明质酸（Hyaluronic acidHA）种分布广泛粘糖广泛分布动物体结缔组织细胞外基质中[12]现结缔组织中脐带皮肤血清鸡冠关节滑液脑软骨眼玻璃体尿鸡胚兔卵细胞动脉静脉壁中分离透明质酸中鸡冠中含量高(7500 mgL)[18]哺乳动物体玻璃体脐带关节滑液中含量较高(4100 mgL)[15]HA 常蛋白质结合粘糖存玻璃体滑液中溶解形式存鸡冠脐带中凝胶形式存[19]透明质酸种天然生物聚合物仅动物体着重生理功时部分细菌中起着重作现已发现产 HA 细菌产气杆菌绿脓杆菌 ABC 溶血性链球菌[20]1937 年Kendall 等[3]发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 合成 HA 分泌胞外形成荚膜产生 HA 链球菌 A 族 C 族A 族中酿脓链球菌等致病性强较少作菌种进行规模发
酵C 族致病性较弱采类菌兽疫链球菌马疫链球菌类马疫链球菌等[21]链球菌外 Pasteurella multocida 产生 HA合成 HA 机制链球菌[22]动物组织提取菌种发酵生产 HA 种属差异化学质分子结构致相分子量[23]
13透明质酸性质途
131透明质酸性质
种源透明质酸均统命名透明质酸动物组织细菌源透明质酸种属差异类动物抗原性[24]透明质酸属生物分子分子链长度分子量均相分子质量范围2×1O57×106般达2×l06护左右双糖单位数30011000[25]水溶液旋光度70°80°[26]氯化钠溶液中葡萄糖醛酸中COOH 解离产生 H＋ HA 呈现酸性聚阴离子状态赋予 HA 酸性粘糖性质：呈白色定形固体臭味具强烈吸湿性溶水溶机溶剂[27]酸性粘糖相直链轴基团间氢键作HA 分子空间呈刚性双螺旋柱型[28]
水溶液中 HA 分子产生分子分子间相互作具特殊理化性质流变学特性数性等Laurent[29] 早机松展具定刚性线圈形容 HA 水中状态HA 水溶液突出物理性质高黏度结构决定[30]HA 具长线性分子链分子链等距离葡萄糖醛酸羧基带负电荷相互排斥分子链呈伸展状态倦缩成团较低浓度HA 分子间强烈相互作具高黏度时具润滑作[31]水溶液中图14[32]HA 分子链间形成疏松网状结构够结合保持量水具较强保水作
图14 HA水溶液中结构
Fig14 The structure of HA in water solution
HA 溶液具独特粘弹性剪切力黏度数值影响溶液受高剪切力作
时黏度降11000 溶液粘弹性着 HA 分子质量浓度增加增加认分子网络形成结果外酸性碱性条件透明质酸酶存条件紫外线臭氧超声波Co 射线温度某金属离子等素均 HA 发生降解[33]
132 透明质酸途
正独特理化性质HA体仅通分子网状结构粘弹性等发挥渗透压调节细胞连接物理屏障机械离缓等功够调节细胞功灭活基等生理活性胚胎形成肿瘤扩散伤口愈合抑制疼痛炎症反应中具重作[34]
1321 HA化妆品中应
HA 具良保湿作皮肤组织中广泛存天然分子优良性已受国际化妆品界广泛关注目前HA 化妆品类已初膏霜乳液化妆水精华素胶囊贴膜扩展浴液粉饼口红洗发护发剂摩丝等[35 36]研究表明体表皮真皮中含高浓度HA占体HA总量半皮肤中含水量HA含量直接相关着年龄增长皮肤老化认皮肤中HA含量降聚合度改变结果[37]含HA护肤品涂皮肤表面时HA形成层粘弹性水化膜维持加强角质层身吸水力屏障功促进皮肤护肤品中活性营养成分吸收防止皮肤干燥[38 39]
HA 阻止细胞中酶产生减少基形成防止基破坏细胞结构产生脂质氧化引起机体衰老等方面起着重作[40]低分子量HA 具抗炎抑制病菌产生保持皮肤光洁作细胞增殖分化提供合适场直接促进细胞生长分化重建修复[41 42]添加透明质酸化妆品已成国际日化界流产品许国家竞相研究开发取定进展日资生堂公司美国 Revlon 公司宝洁公司国永芳然美北京宝等品牌[43]
1322 HA保健食品中应
20世纪80年代末口服HA美容保健食品出现日基理：HA通口服消化吸收增加体HA合成前体皮肤组织中HA合成量增加皮肤饱水性增加富弹性皱纹减少[44]
体胚胎时期体 HA 含量高出生逐渐减少果 20 岁体 HA 相含量作 100305060 岁时分降 654525[45]相年龄群中含 HA 早老症患者 HA 含量较少显示衰老症状婴体 HA 含量成 20 倍左右显示出 HA 皮肤作[46]口服HA 保健品补充体 HA 缺失口服HA补充体HA足预防组织细胞老化特维持老年健康具特殊功[47]日国台湾均HA美容保健食品市现口服HA美容保健食品受越越
重视接受
1323 HA床医学中应
HA 构成关节软骨滑液成分滑液滑膜细胞吞噬细胞等合成[48 49]滑液中 HA 赋予滑液高度弹性润滑作具吸收应力减轻组织磨擦功HA蛋白形成复合物覆盖软骨表面形成薄定型结构层该结构具强变形性弹性起滑动层吸收应力作关节受力产生滑动时该结构先软骨表层破坏缓作发挥保护软骨维持软骨基质完整等功补充外源性高分子量 HA 治疗关疾病Balazs等先提出[50]认补充外源性 HA 病理状况滑液恢复正常状态重建润滑屏障保护功高粘弹性 HA 溶液代滑液关节提供应保护屏障功时病变关节创造然修复时间软骨然修复愈合外[51]高分子量 HA 抑制血组织增生抑制炎症反应屏蔽痛觉感受器明显缓解症状
HA现代眼科手术理想原料眼科手术中优良粘合剂润滑剂制成滴眼药玻璃体代品等[52]眼球晶体移植手术具较强粘度眼科粘性手术中理想唯效材料HA溶液具高度粘弹性术中注入前房效支撑前房时涂布眼组织表面手术器械表层形成保护膜避免器械损伤[15 53]HA眼组织保护作机理时方面仅局限机械缓垫作广泛应眼制剂中[15]HA身体天然存成分具生物相容性安全性
透明质酸床医学应外促进伤口愈合防粘连耳科疾病[54]血清中透明质酸检测[55]等床应中具重意义
14 透明质酸生产
141动物组织提取法
1934 年美国 Meyer Palmer 等首先牛眼玻璃体中分离出 HA 国外学者围绕 HA 性质生产开展量研究包括HA 生产工艺合成机制等[19 56 57]HA生产分两类动物组织原料提取法细菌发酵法
HA 存动物组织中分布广泛提取 HA 传统方法动物组织原料含量分子量考虑原料 HA 含量高低数量少易取程度等成素够生产原料鸡冠脐带动物眼球工艺程包括提取杂酶解沉淀分离组织 HA 提取纯化程定差[58 59]
动物组织提取法原料求较高原料必须新鲜采集冷冻处理动物原料组织价格昂贵源困难[60 61]动物原料组织中 HA 纯度低收率低提取程中消耗量机溶剂酶操作单元工艺复杂会
增加制备 HA 成该工艺原料源局限性产品提取率极低仅 1 左右工艺程序复杂生产成居高造成商品价格昂贵限制医药化妆品中广泛应宜进行工业化生产[62]雄鸡鸡冠中HA 蛋白糖结合分离高度纯化高分子量 HA 成更加昂贵更重：利动物源生化产品进行类治疗遇越越阻力产生病毒种间交叉感染风险性感染[63 64]源更受欢迎微生物发酵法开始逐渐代提取法生产 HA
142微生物发酵法
链球菌属种细菌 HA 成分荚膜图 15微生物发酵法利链球菌生长繁殖程中胞外分泌[65] HA 成分荚膜通分离纯化制备HA
图 15 链球菌荚膜示意图
Fig 15 Schematic program of capsule of streptococcus
HA 产生菌葡萄糖糖类作碳源蛋白胨酵母膏等氮源营养物质组成培养基特定条件培养发酵发酵结束滤精制菌体蛋白核酸机酸链球菌代谢生成复杂产物等杂质乙醇沉淀纯化等程序高纯度 HA 产品[66 67]
动物组织提取法相微生物发酵法具成低生产规模受动物原料限制发酵液中HA 游离状态存易分离纯化形成规模化工业生产动物源致病菌污染等优势[68]种源 HA 种属差异动物组织提取菌种发酵生产 HA化学质分子结构致相分子质量差[10]
1421 HA微生物合成途径
年研究[6973]确定 HA 合成需图 16 示途径合成 HA 两前体葡萄糖醛酸乙酰氨基葡萄糖葡萄糖种酶作分产生UDP葡萄糖醛酸 UDPN乙酰氨基葡萄糖 HA 合成酶(HasA)作合成 HA
图 16难出 HA 合成前体 1P葡萄糖UDP葡萄糖 UDPN乙酰氨基葡萄糖胺时合成细胞壁(约占细胞干重 20ww) HA 合成细胞生长间存着碳源竞争关系兽疫链球菌发酵生产 HA 重代谢特性[74 75]时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产途径)代谢产物乳酸乳酸细胞生长 HA 合成较强抑制作效转变细胞产途径降低乳酸细胞生长HA合成抑制作提高整发酵程生产强度生产效率具重意义[76]
图 16兽疫链球菌HA 生物合成途径
Fig 16 The biological synthesis pathway of HA in S zooepidemicus
1422 HA 合成分泌分子生物学机制
Dougherty Van de Rijn A 群链球菌研究发现 HA 前体合成 HA 合成需酶细胞膜关[77]透明质酸合成酶(hasA)链球菌中透明质酸合成操子中酶透明质酸合成关兽疫链球菌中操子中五基[78]：HA 合酶 (EC 241212 hasA) UDP葡萄糖脱氢酶(EC 11122 hasB) UDP葡萄糖焦磷酸化酶 (EC 2779 hasC) 具乙酰转移酶焦磷酸化酶活性双
功酶 (EC 2314EC 27723 hasD) 磷酸葡糖异构酶(EC 5319 hasE)
HA 前体简单酶作合成 HA真核原核微生物中形成原生质膜相关蛋白复合物催化 HA 合成运输[23 79 80]A 群链球菌 HA 分子链延长源 HA 非原端进行程 Mg2+存条件仅 UDP葡萄糖醛酸 UDPN乙酰葡萄糖胺底物合成 HA[81 82]合成时 UDPN乙酰葡萄糖胺 UDP葡萄糖醛酸交连接 HA 链反应进行非常快分钟约 100 糖单位
图 17 透明质酸合成酶合成分泌透明质酸程示意图[83]
Fig 17 Schematic program for the synthesis and secretion of HA by HA synthase
然目前 HA 长度控制机制尚结研究员提出三种机制[84]：(1) 透明质酸合成酶肽链存特定区域位点直接感应延伸中 HA 长度控制合成开始结束(2) 透明质酸合成酶 HA 亲力亲力决定延伸长度延伸中 HA 链环境受剪切力溶液布朗运动等产生合外力链长度呈正相关 HA 延伸定长度受外力合起透明质酸合成酶亲力时HA 释放催化反应停止 HA 透明质酸合成酶亲力高倾合成较长 HA反然(3) 透明质酸合成酶外检测 HA长度蛋白存产生信号转导透明质酸合成酶控制 HA 合成
15透明质酸酶简介
透明质酸酶（hyaluronicdaseHAase）透明质酸产生低分子化作酶总称透明质酸构成宿结缔组织细胞外基质成分根全国科学技术名词审定委员会公布生物化学名词hyaluronic acid译透明质酸药学名词药品国家标准称玻璃酸两者物质透明质酸酶称玻璃酸酶透明质酸酶透明质酸（HA）分子发生酶解子 HA 分子部
机切割 HA 分子产生 HA 分子片段降低 HA分子间相互作释放束缚水分子然降解 β13 糖苷键 β14 糖苷键酶作 HA 分子片段逐步 GlcA GlcNAc 降解
151 透明质酸酶分布
透明质酸酶分布动物细菌中否植物真菌中量含相关研究较少动物体血液尿液肝脏等组织均含透明质酸酶许微生物产生透明质酸酶革兰氏阴性菌产生酶胞质分泌保外环境中致病中酶更软骨素酶菌类产气单胞菌属弧菌属变形杆菌属梭形杆菌属脆弱类杆菌属产透明质酸酶革兰氏阳性菌链球菌属丙酸杆菌属葡萄球菌属拟杆菌属链霉菌属梭菌属等酿脓链球菌马链球菌温噬菌体产透明质酸酶细胞环境中未检测酶活性
152 透明质酸酶性质
根源结构作机制1952年Meyer等分三类[85]图18（1）切βN乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 32135）脊椎动物源动物毒液属类研究睾丸蜂毒溶酶体透明质酸酶类酶水解酶作β14糖苷键终产物四糖作软骨素硫酸软骨素转糖苷酶活性（2）细菌透明质酸酶（EC 4221）称透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase）种碱性糖蛋白该酶属切βN乙酰氨基葡萄糖苷酶源细菌通β消机制饱双糖催化透明质酸作软骨素硫酸软骨素（3）切β葡萄糖醛酸苷酶（EC 32136）类透明质酸酶源水蛭十二指肠虫作β13糖苷键降解产物四糖特异性降解HA降解软骨素硫酸软骨素
图18 透明质酸酶分类
Fig 18 The classification of hyaluronicdases
根适pH值脊椎动物源透明质酸酶分中性型酸性型两类：
适pH50左右中性型透明质酸酶睾丸微生物蛇昆虫毒素含透明质酸酶适pH3540左右酸性型透明质酸酶正常血清尿肝脏含透明质酸酶肿瘤组织中酸性型着分子技术发展根氨基酸序列源性透明质酸酶分原核生物透明质酸酶真核生物透明质酸酶两类
透明质酸酶具种特征菌株整生长期产生菌株特定生长期产生菌株透明质酸分解酶分泌发酵液中菌株原生质膜含菌株透明质酸分解酶数量活力[57]透明质酸分解酶活力低合成酶活力高菌株数具厚浓荚膜透明质酸酶特征认菌株生产 HA 力密切相关HA酶具稳定性长时间耐受 60℃机溶剂影响HA 生产中 HA 会酶分解提高 HA 产量发酵培养基中添加 HA 酶抑制剂藻酸硫酸盐（01 mgmL）减少 HA酶 HA 分子降解HA酶抑制剂会增加发酵液颜色 HA 分子紧密结合 HA 分离纯化工艺带麻烦影响 HA 回收率品质目前许透明质酸酶基克隆功确认
153 透明质酸酶途
透明质酸酶体暂时降低细胞间质粘性促皮输液局部积贮渗出液血液加快扩散利吸收种重药物扩散剂床作药物渗透剂促进药物吸收促进手术创伤局部水肿血肿消散缓慢速度进行静脉滴注药物种氨基酸水解蛋白等加快扩散利吸收透明质酸酶功细菌提供生长增殖必须碳源源透明质酸降解饱双糖原
154 链球菌透明质酸酶致病性关系
然链球菌属透明质酸酶致病机制致相均降解透明质酸降低细胞外基质粘度破坏宿物理防御屏障利细菌毒素扩散宿细胞暴露细菌种毒素中发病源透明质酸酶疾病发病程中作完全致
链球菌引起类疾病种化脓性炎症猩红热细菌性心膜炎新生败血症肾球炎风湿热等[25]目前已知引起链球菌相关疾病毒力子外毒素表面蛋白链球菌溶素透明质酸酶链激酶等相关酶类中透明质酸酶致病机制分解细胞外基质透明质酸病菌易组织中扩散名扩散子
乳链球菌属B族链球菌感染类牲畜重病原菌引起牛乳房炎危害畜牧业感染类引起败血症脑膜炎病死率极高尤新生目前该病菌致病机制尚未完全阐明相关报道[17]筛选出致病物质中包
括糖荚膜C蛋白溶血素透明质酸酶细胞外基质中检测产高水透明质酸酶致病株血清3型B族链球菌床研究证实该型菌株较型产较少透明质酸酶菌株毒力更说明细胞外基质透明质酸降解细菌入侵扩散程中起着极重作酿脓链球菌属A群链球菌生长早期形成荚膜起抗宿细胞吞噬作透明质酸构成荚膜成分着细菌进入数生长期透明质酸酶产生增荚膜逐渐减少研究[35]发现荚膜消失宿细胞吞噬细菌未明显增细菌吞噬子M蛋白抗吞噬作关然透明质酸酶酿脓链球菌毒力子体外细菌培养中检测透明质酸酶菌株超25引发令深思问题体外检测体否检测该酶存？酿脓链球菌透明质酸酶步研究方
16文研究意义容
161课题研究意义
课题研究兽疫链球菌中两种透明质酸酶基hylZhylB产透明质酸代谢产物影响透明质酸应医药化妆品保健食品中种重糖提高发酵生产 HA 产量拓展 HA 应范围探索 HA 特性应影响直国外研究热点细菌源透明质酸酶类够水解透明质酸产生分子饱双糖碱性蛋白酶类目前通基工程方法定透明质酸酶进行改造灭活研究少尤透明质酸生产代谢影响国没发现相关文献报道
162课题研究容
实验成功构建hylBhylZ两种透明质酸酶基敲载体成功通双交换两种基实现插入灭活图19具体容：
（1）实验室菌株兽疫链球菌ATCC39920NCBI数库中没获基组序列相关信息透明质酸酶相关基NCBI进行Blast搜索时发现ATCC35246MGCS10565hylBhylZ基具高相似性根ATCC35246相关序列进行相关引物设计
（2）PCR扩增克隆透明质酸酶基hylBhylZ
（3）助分子生物学方法构建透明质酸分解活力降低丧失菌株pSET4s作出发载体克隆PCR扩增透明质酸分解酶基片段连接pSET4s载体然透明质酸分解酶基片段中部选择合适酶切位点插入抗性基选择标记具体步骤图19
（4）构建成功敲载体分导入相应菌株中通源重组方法获目基失活菌株
（5）构建成功透明质酸酶基失活工程菌进行罐发酵检测两种基否菌株代谢产生影响
图19 敲载体构建策略
Fig 19 The strategies for construction of Knockout vector
2 材料方法
21 实验材料
211 菌种质粒引物
研究中菌种质粒表21列兽疫链球菌ATCC 39920购美国标准菌库肠杆菌相关质粒实验室保存
表21 研究菌种质粒
Table 21 Bacterial strains and plasmids used in this study
Strains or plasmids
Relevant characteristics
Sources
Strains
S zooepidemicus ATCC39920
Wildtype strain
ATCC
E coli JM109a
recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44
Gibco BRL
JM109pSET4skana
E coli JM109 harboring
pSET4skana
This work
S zooepidemicus
pSET4skana
S zooepidemicus harboring
pSET4skana
This work
JM109pSET4scmr
E coli JM109 harboring
pSET4scmr
This work
S Zooepidemicus
pSET4scmr
S zooepidemicus harboring
pSET4scmr
This work
S Zooepidemicus
pSET4scmr
S zooepidemicus harboring
pSET4scmr
This work
ΔHylZ
hylZ deletion mutant
kanar
This work
ΔHylB
hylB deletion mutant
cmr
This work
ΔHylZB
hylZ and hylB deletion mutant
kanarcmr
This work
Plasmids
PMD 18T
Tvector for routine cloning ampr
Takara
pSET 23b TrixB
Protein expression
This work
pSET1
provide the chloramphenicol promoter sequence
This work
pSET4s
E coliStreptococcus shuttle vector spcr
This work
pSET4shylZ
pSET4shylZ harboring the 5’ and 3’ flanking sequences of hylZ kanar
This work
pSET4shylB
pSET4sΔhylB harboring the 5’ and 3’ flanking sequences of hylB cmr
This work
212 培养基
(1) THB培养基：(1L)
牛肉浸粉 10 g
胰蛋白胨 20 g
葡萄糖 20g
碳酸氢钠 20g
氯化钠 20g
磷酸氢二钠 04g
加蒸馏水定容1L调PH78±02
(2) THB固体培养基：(1L)
THB培养基中加入15琼脂
(3) THY培养基：(1L)
牛肉浸粉 10 g
胰蛋白胨 20 g
葡萄糖 20g
碳酸氢钠 20g
氯化钠 20g
磷酸氢二钠 04g
酵母提取物 20g
加蒸馏水定容1L调PH78±02
(4)TSB培养基：(1L)
胰蛋白胨 17 g
豆蛋白胨 30g
葡萄糖 20g
磷酸氢二钾 04g
氯化钠 20g
加蒸馏水定容1L调PH72±01
(5) LB培养基：（1L）
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 50g
NaCl 10g
加蒸馏水定容1L
213 试剂
（1）工具酶
表22 文相关酶
Table 22 Relative enzymes used in the study
酶
生产厂商
Taq DNA聚合酶
Fermentas
KOD FX
东洋纺（海）生物科技限公司
BamH I
Fermentas
Pst I
Fermentas
DraⅢ
Fermentas
T4 DNA连接酶
Fermentas
（2）试剂盒Marker
表23 实验试剂盒
Table 23 Reagent Kit and Marker
产品
生产厂商
DNA凝胶电泳纯化回收试剂盒
北京索莱宝科技限公司
质粒提试剂盒
北京索莱宝科技限公司
1 kb DNA Ladder Marker
Fermentas
（3）化学试剂
表24 实验化学试剂
Table 24 Chemical reagents
试剂
等级
生产厂商
葡萄糖
分析纯
**市化学试剂厂
蔗糖
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯化钠
分析纯
**市四通化工厂
氢氧化钠
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
硝酸铵
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
浓盐酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
浓硫酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
冰乙酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
柠檬酸
色谱级
**市元立化工化学试剂厂
磷酸二氢钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
磷酸氢二钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
醋酸钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
七水硫酸镁
分析纯
**市四通化工厂
七水硫酸亚铁
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
二水氯化钙
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
MES
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
七水硫酸锌
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
四水氯化锰
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
六合水氯化钴
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
五水硫酸铜
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
二合水钼酸钠
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
硼酸
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
水硫酸锰
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯化钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
DMSO
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
异戊醇
分析纯
**市化学试剂三厂
异丙醇
分析纯
**市化学试剂三厂
Glycerol
分析纯
**市化学试剂三厂
乙二胺四乙酸
分析纯
**市化学试剂三厂
琼脂粉
生物级
北京索莱宝科技限公司
水乙醇
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氯仿
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
氢氧化钾
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
苯酚
分析纯
**市北方天医化学试剂厂
Tris
超纯级
北京索莱宝科技限公司
琼脂糖
电泳级
美国OXOID公司
溴酚蓝
分析纯
海生物工程限公司
氨苄青霉素
生化级
美国Sigma公司
卡霉素
生化级
美国Sigma公司
链霉素
生化级
美国Sigma公司
潮霉素
生化级
美国Sigma公司
胰蛋白胨
生化级
美国OXOID公司
酪蛋白胨
生化级
美国OXOID公司
酵母提取物
生化级
美国OXOID公司
214 仪器
表24 实验仪器
Table 24 Instrument used in the study
仪器
生产厂商
基脉导入仪
美国BIORAD公司
凝胶成仪
美国BIORAD公司
PTC200型PCR仪
eppendorf
pH计
梅特勒托利仪器海公司
AB204S型分析天
梅特勒托利仪器海公司
移液器
eppendorf
DYYIII2型稳压稳流电泳仪
北京六仪器厂
DYCZ24D型电泳槽
北京六仪器厂
TGL16C台式离心机
海安亭科技仪器厂
高速冷冻离心机GL20A
日日立限公司
HG753电热恒温培养箱
**实验仪器厂
ZHWY211B控温摇床
海志诚设备厂
SCDII型高纯水装置
军事医学科学院卫生装备研究
SS325型全动灭菌锅
日TOMY仪器限公司
SHAB水浴恒温振荡器
江苏国华仪器厂
紫外分光光度计
北京普析通仪器责限公司
215 实验溶液
2151 葡糖醛酸含量测定溶液
（1）硼砂硫酸液
称取四硼酸钠477g溶浓硫酸(AR)500mL中
（2）咔唑试液
称取咔唑0125g溶乙醇(AR)100mL中置棕色瓶中冰箱保存
（3）提取缓液：NaCl 100 mmolLEDTA 50 mmolLTrisHCl 50 mmolL pH 85SDS 1
（4）1 molL TrisHCl
称取12114 g Tris加水1 LHCl调pH80121 ℃灭菌15 min
（5）电泳缓液（50×TAE）
Tris 242g冰乙酸 571 mL05 molL EDTA（pH 80）100 mL加水定容1 L121 ℃灭菌15 min室温保存备
（6）500 mmolL 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH80）
800 mL 双蒸水中加入 186 g 乙二铵四乙酸二钠充分溶解 10
molLNaOH 溶液调 pH 80双蒸水定容 1000 mL121℃高压灭菌 15 min备
（7）TE 缓液（pH80）
1 molL TrisHCl（pH80）10 mL 500 mmolL EDTA（pH80）溶液 2 mL双蒸水定容 1000 mL121℃高压灭菌 15 min备
（8）10 SDS
10 g 高纯度 SDS 置烧杯中加入约 80 mL ddH2O68℃加热溶解滴加盐酸调节 pH 值 72定容 100 mL 室温保存
22 实验方法
221菌种培养方法
(1)肠杆菌培养
肠杆菌培养均 LB 培养基中37℃培养 24 h需加入抗生素时氨苄青霉素终浓度 100 μgmL氯霉素 10 μgmL
(2)兽疫链球菌培养
保存80℃甘油中兽疫链球菌取出接种 10 mL 液体培养基中37℃200 rpm 振荡培养夜菌液稀释涂布固体THB板37℃培养 24 h形成明显单菌落
挑取单菌落接种装 10 mL 液体培养基试中摇床200 rmin 培养14 h～16 h培养温度设37℃然8接种量述培养液接入盛50 mL液体培养基三角瓶中振荡培养 14 h
222 琼脂糖凝胶电泳
（1）称取定量琼脂糖（1）加入1×TAE微波炉中加热琼脂糖完全溶解分离效果见表25
表25 琼脂糖凝胶线性分离范围
Table 25 Separating scope of agarose gel
Agarose concentration（）
Separate scope（kb）
03
560
06
120
07
0810
09
057
12
046
15
023
（2）溶液冷60 ℃时加入溴化乙锭终浓度05 μgmL
（3）琼脂糖倒入制胶模具中迅速模具端插梳子
（4）琼脂糖溶液完全凝固心取出梳子凝胶置电泳槽中
（5）电泳槽中加入电泳缓液高胶面1 mm
（6）电泳样品中加入6×溴酚蓝样缓液混匀加入样品孔中
（7）接通电源电压特殊求般120 V
（8）根溴酚蓝指示剂迁移位置断定否终止电泳
（9）电泳完毕取出凝胶检测电泳结果
（10）DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收
223 兽疫链球菌基组DNA提取
（1）兽疫链球菌活化接种30ml THY培养基中200rpm 37℃夜培养取20ml菌液12000rpm离心10min收集菌体
（2）加入4ml01SDS 37℃ 200rpm 处理30min取1ml 12000rpm 离心5min弃清加入500ulTE蔗糖溶液重悬加入终浓度10mgml 溶菌酶37℃处理1h加入浓度20mgml蛋白酶K 55℃温育3h
（3）80℃灭活蛋白酶K
（4）加入终浓度25mol醋酸铵冰浴20min
（5）12000rpm 离心20min转移清05ml新2mlEP中
（6）加入2倍体积冰冷水乙醇沉淀10min 12000rpm离心10min1ml 75乙醇洗涤12000rp离心5min弃清
（7）室温晾干加入70ul菌水TE缓液溶解20℃冻存
224 胶回收DNA
（1）单目 DNA 条带琼脂糖凝胶中切（量切余部分）放入干净离心中称取重量
（2）胶块中加入 3 倍体积溶胶液（果凝胶重 01g体积视 100µl加入300µl 溶胶液） 5055℃水浴放置 10 分钟间断温翻转离心确保胶块充分溶解
注意：溶胶时果溶胶液变红色（正常情况淡黄色）含 DNA胶溶液中加 10–30µl 3M 醋酸钠（pH52）溶胶液调淡黄色否会影响 DNA 吸附柱结合影响回收效果
（3）步溶液加入吸附柱中（吸附柱放入收集中）13000rpm 离心 3060秒倒掉收集 中废液吸附柱重新放入收集中
注意：胶块完全溶解胶溶液温度降室温柱吸附柱较高温度时结合 DNA 力较弱
（4）吸附柱中加入 700μl 漂洗液（前请先检查否已加入水乙醇）13000rpm离心 3060 秒倒掉废液吸附柱重新放入收集中
（5）吸附柱中加入 500μl 漂洗液13000rpm 离心 3060 秒倒掉废液
（6）12000 rmin离心2 min敞口置室温段时间
（7）加入50 μL 65 ℃预热TE放置5 min12000 rmin离心2 min
（8）回收质粒置20 ℃
（9）冰放置分钟制成感受态细胞悬液
（10）感受态细胞分装成100 μL份贮存70 ℃保存
225 DNA酶切连接
实验中 DNA 限制性切酶反应限制性切酶说明进行载体 DNA 限制性切酶消化琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒回收纯化目片段连接反应DNA 片段连接反应参连接酶说明 10 μL 反应体系中加入 2μL 连接反应缓液l μL T4 DNA 连接酶载体 DNA(100 ng)外源 DNA 摩尔 131516℃连接夜连接产物全部转化肠杆菌感受态细胞
226 肠杆菌转化
2251肠杆菌感受态细胞制备
（1）保藏80℃肠杆菌划线新鲜 LB 板37℃培养 12 h～16 h单菌落清晰
（2）挑取单菌落接种含3ml LB 培养液10ml试中培养约 12 h
（3）取 2ml 夜培养菌液接种装 100mL LB培养基500ml三角瓶中37℃ 200rpm振荡培养23h(时肠杆菌生长处数期中期OD6000506细胞数约47×107ml1)
（4）装菌液三角瓶置冰冰浴 1030min4℃ 5000 rpm 离心10 min
（5）倾清加 20 mL 预冷 01 molL Mgcl2混匀冰放置 10 min
（6）4℃ 5000 rpm 离心 10min倾清
（7）加入 25 mL 预冷 01 molL Cacl2混匀冰放置 20 min
（8）4℃ 5000 rpm 离心 10min倾清
（9）加入 5 mLCacl2（01 molL） 1 mL 甘油
（10）分装已灭菌 EP 中 100 μL转化80℃保存备
2252肠杆菌感受态细胞转化
（1）80℃冰箱中取出肠杆菌感受态置冰融化
（2） 10 μL 混合体系（载体目基）加入 100 μL 肠杆菌感受态中混匀冰浴30 min
（3）42℃热激 90 s然冰浴 2 min
（4）加入 900 μL LB 液体培养基37℃摇床（200 rpm）培养 45min
（5）5000 rpm 离心 3 min弃清
（6）加入 200 μL LB 液体培养基菌液分涂布相应抗性LB 固体板
（7）固体板置培养箱中37℃倒置培养 12 h～14 h
2253肠杆菌阳性克隆筛选验证
实验采敲策略目基部插入抗性基图21发生源重组透明质酸基断目蛋白失活筛选时般含抗生素固体板长出单菌落阳性克隆单菌落需进步验证板挑取单菌落 3mL LB 液体培养基(含抗生素)中37℃振荡培养 12 h～14 h取菌液进行 PCR然 1琼脂糖凝胶电泳选择扩增出目基菌株 1接种量接种20 mL LB液体培养基(含抗生素)中37℃振荡培养12 h～14 h少量提取质粒电泳检验质粒 DNA 提取情况立进行双酶切进步验证外源片断否插入酶切反应体系提供限制性切酶说明书进行 10 μL 反应体系中加入 2 μL 酶切反应缓液切酶 l μL质粒 4 μL～6 μL37℃恒温酶切 2 h～4 h 电泳检查酶切结果
（a）
（b）
（c）
图 21 基敲策略双交换模型
Fig 21 Strategies of gene knockout and doubleexchange model
(a) 敲策略采插入破环法图酶切位点(b) 双交换模型
(c)成功发生双交换抗性基整合目标基中部目基失活
2254 肠杆菌质粒提取
(1) 取 3 mL 夜培养肠杆菌菌液12000 rpm 离心 2 min弃清
(2) 250 μL Solution I 充分悬浮细菌沉淀
(3) 加入 250 μL SolutionⅡ轻轻翻转 5～6 次菌液充分裂解形成透明溶液
(4) 加入 400 μL SolutionⅢ 轻轻翻转 5～6 次直形成紧实凝集块然室温放置 2 min
(5) 室温 12000 rpm 离心 10 min取清
(6) 试剂盒中 Spin Column 安置 Collection Tube
(7) 述操作 5 清液转移 Spin Column 中12000 rpm 离心 1 min弃滤液
(8) 500 μL RinseA 加入 Spin Column 中12000 rpm 离心 30 s弃滤液
(9) 700 μL RinseB 加入 Spin Column 中12000 rpm 离心 30 s弃滤液
(10) 重复操作 9
(11) Spin Column 安置新 15 mL 离心 Spin Column 膜：中央加入 40 μL加热 60℃ Elution Buffer室温静置 1 min
(12) 12000 rpm 离心 1 min 洗脱 DNA
(13) 取 4 μL 洗脱液电泳
23 透明质酸酶基hylB克隆
231透明质酸酶基hylB引物设计
根Genbank中公布ATCC 35246透明质酸酶基序列引物设计序列：
UPhylB：GTCACTGCAGGTAGCTATGG AATCCAGTCTTG（划线PstI酶切位点）
DWhylB：CAGTGGATCCGCCCACGACTCATATCCATGAG（划线BamHI酶切位点）
232透明质酸酶基hylB克隆
(1) 基组DNA模板UPhylBDWhylB引物进行PCR扩增反应体系
表26 20μL PCR反应体系
Table 26 20 uL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约16 kbDNA片段
（3） 切酶PstI BamHI胶回收目片段克隆载体pSET4s进行双酶切
表27 20μL DNA片段酶切体系
Table 27 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
hylB 基片段
5μL
pSET4s载体
2μL
1×K Buffer
2μL
1×K Buffer
2μL
PstI
1μL
PstI
1μL
BamHI
1μL
BamHI
1μL
dd H2O
10μL
dd H2O
14μL
反应条件：述体系37℃反应夜酶切产物进行纯化回收参考2243
（4） 目片段 pSET4s 载体双酶切纯化产物连接
表28 20μL DNA片段连接体系
Table 28 20μL DNA fragments ligated system
名称
体积
pSET4s 载体酶切产物
1μL
hylB基酶切产物
5μL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer
1μL
T4 DNA 连接酶
1μL
ddH2O
4μL
反应条件：述体系16℃反应夜
（5） 10 μL 连接体系转化肠杆菌感受态助氯霉素（10 μgmL）抗性筛选菌落PCR 验证选择阳性转化子进行培养
（6）少量提取质粒PstIBamHI 质粒进行双酶切验证200 μL反应中建立
表29 重组质粒酶切体系
Table 29 recombinant plasmid digestion system
名称
体积
重组质粒
6μL
PstI
1μL
BamHI I
1μL
1×K Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37℃作2 h电泳检测
(7) PCR质粒提取酶切等鉴定确定含重组质粒肠杆菌转化子培养OD600 04～08送华基公司进行测序
24 透明质酸酶基hylZ克隆
241透明质酸酶基hylZ引物设计
根Genbank中公布MGCS 10565透明质酸酶基hylZ序列引物设计序列：
引物序列：
UPhylZ： GTGAGGATCCCCTGATGTAG CACCTCCCCACC（划线BamHI酶切位点）
DWhylZ：GAGTCTGCAGGACGGCGTCT TGTCAGCTTCCT（划线PstI酶切位点）
242 目片段hylZ 克隆
（1） 基组DNA模板UPhylZ DWhylZ引物进行PCR扩增
表210 20μL PCR反应体系
Table 210 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约16 kbDNA片段
（3） 切酶PstI BamHI胶回收目片段克隆载体pSET4s进行双酶切
表211 20μL DNA片段酶切体系
Table 211 20μL DNA fragments digestion system
名称
体积
名称
体积
hylZ 基片段
5μL
pSET4s载体
2μL
1×K Buffer
2μL
1×K Buffer
2μL
PstI
1μL
PstI
1μL
BamHI
1μL
BamHI
1μL
dd H2O
10μL
dd H2O
14μL
（4） 目片段 pSET4s 载体双酶切纯化产物连接
表212 20μL连接体系
Table 212 20μL ligation system
名称
体积
pSET4s 载体酶切产物
1μL
hylZ基酶切产物
5μL
10×T4 DNA 连接酶 Buffer
1μL
T4 DNA 连接酶
1μL
ddH2O
4μL
述溶液混合均匀16℃夜连接
（5） 10 μL 连接体系转化肠杆菌感受态助卡霉素（100 μgmL）抗性筛选菌落 PCR 验证选择阳性转化子进行培养
（6） 少量提取质粒PstIBamHI 质粒进行双酶切验证200 μL反应中建立
表213 20μL重组质粒酶切体系
Table 213 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
重组质粒
6μL
PstI
1μL
BamHI I
1μL
1×K Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37℃作2 h电泳检测
（7） PCR质粒提取酶切等鉴定确定含重组质粒肠杆菌转化子培养OD600 04～08送华基公司进行测序
25 基敲载体构建
251 PCR 扩增氯霉素（cmr）抗性基
（1）根质粒氯霉素（cmr）抗性基序列引引物[86]PCR扩增氯霉素（cmr）抗性基完整阅读框引物序列：
CMUP：CATGCACTTTGTGTAATTCGATGGGTTCCGAGG（划线DraIII酶切位点）
CMDW：CATGCACAAAGTGCACCGAACTAGAGCTTGATG（划线DraIII酶切位点）
表214 20μL PCR反应体系
Table 214 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约10 kbDNA片段
252 PCR 扩增卡霉素（kana）抗性基
（1）根质粒卡霉素（kana）抗性基序列引引物[61]PCR扩增卡霉素（kana）抗性基完整阅读框引物序列：
KANAF：GTGACACAATGTGTCCCCTGGATACCGCTCG（划线DraIII酶切位点）
KANAR：GAGTCACATTGTGGAACCCCAGAGTCCCGC（划线DraIII酶切位点）
表215 20μL PCR反应体系
Table 215 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（2）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
扩增产物1凝胶电泳检验胶回收约10 kbDNA片段
253 基敲载体 pSET4Scmr pSET4Skana构建
2531基敲载体 pSET4Scmr
（1）切酶DraIII已连接hylB目基pSET4S质粒pSET4ShylB氯霉素（cmr）抗性基进行单酶切磷酸化处理
表216 20μL DNA片段酶切体系
Table 216 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
质粒 pSET4ShylB
2μL
氯霉素抗性基
10μL
DraIII
1μL
DraIII
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
dd H2O
15μL
dd H2O
6μL
（2）酶切纯化产物13摩尔混匀加入T4连接酶4℃连接夜
（3）连接产物转化肠杆菌筛选抗氯霉素（cmr）转化子UPhylB DWhylB引物组合转化子进行菌落PCR验证PCR验证体系程序：
表217 20μL PCR反应体系
Table 217 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
（4）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
（5）PCR产物1琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选获26kb条带转化子进行培养
（6）提取质粒命名pSET4Scmr切酶DraIII 质粒进行酶切验证 酶切体系：
表218 20μL重组质粒酶切体系
Table 218 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
质粒pSET4Scmr
5μL
DraIII
1μL
10×FastDigest Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37 ℃作2 h电泳检测
（7）酶切验证阳性质粒基敲载体pSET4Scmr
2532基敲载体 pSET4Skana
（1）切酶DraIII已连接hylZ目基pSET4S质粒pSET4ShylZ卡霉素（kana）抗性基进行单酶切磷酸化处理
表219 20μL DNA片段酶切体系
Table 219 20μL DNA fragment digestion system
名称
体积
名称
体积
质粒pSET4ShylZ
2μL
卡霉素抗性基
10μL
DraIII
1μL
DraIII
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
10×FastDigest Buffer
2μL
dd H2O
15μL
dd H2O
6μL
（2）酶切纯化产物13摩尔混匀加入T4连接酶4℃连接夜
（3）连接产物转化肠杆菌筛选抗卡霉素（kana）转化子UPhylZ DWhylZ引物组合转化子进行菌落PCR验证PCR验证体系程序：
表220 20μL PCR反应体系
Table 220 20μL PCR reaction system
名称
体积
游引物（50μmolL）
1μL
游引物（50μmolL）
1μL
dNTP混合物（10mmolL）
1μL
10×PCR缓液
4μL
MgCl2
75μL
Taq DNA聚合酶
05μL
双蒸水
5μLμL
菌超纯水补足总体积 50 μL
（4）述程序进行扩增：
① 94℃ 预变性 3min
② 94℃ 变性 1min
58℃ 退火 1min
72℃ 延伸 15min 30循环
③ 72℃ 延伸 5min
（5）PCR产物1琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选获26kb条带转化子进行培养
（6）提取质粒命名pSET4Scmr切酶DraIII 质粒进行酶切验证 酶切体系：
表221 20μL重组质粒酶切体系
Table 221 20μL recombinant plasmid digestion system
名称
体积
质粒pSET4Skana
5μL
DraIII
1μL
10×FastDigest Buffer
2μL
ddH2O
10μL
37 ℃作2 h电泳检测
（7）酶切验证阳性质粒基敲载体pSET4Skana
26 兽疫链球菌转化突变株筛选
261兽疫链球菌感受态细胞制备[13]
（1）80℃保藏甘油中接入THY液体培养基中37℃ 200rpm 活化24h稀释105106倍涂布THB板37℃培养24h
（2）挑取单菌落接入THY液体培养基中37℃ 200rpm培养培养1214h
（3）1接种新鲜100mlTHY液体培养基中37℃200rpm培养OD530约037加入海生工生产透明质酸酶125ku继续培养30min培养结束时OD530约058
（4）培养结束冰浴10min停止生长
（5）灭菌50ml离心12000rpm 4℃离心10min
（6）清加入冰冷05M蔗糖溶溶液液20ml重悬菌体
（7）12000rpm 4℃离心10min
（8）弃清5ml冰冷05M蔗糖溶液重悬菌体
（9）12000rpm 4℃度离心10min
（10）弃清加入500μL含15甘油05M蔗糖溶液重悬菌体 50μL等体积分装菌15mLEP中立电转者放入80℃冰箱中冻存
262兽疫链球菌感受态细胞电转化
（1）取4ul质粒加入50ul感受态中混匀
（2）转移2mm遇冷电转杯中25kv20025uF电击（果1mm电转杯电压设置1517kv）
（3）电击立加入复苏液THY培养基转移EP中
（4）30℃复苏34h
（5）12000rpm离心2min集菌
（6）清剩余100200ul涂布相应抗性板
（7）28℃培养4876h
（8）挑取转化子进行单双抗二次验证
（9）筛选克隆接种CmR抗性THY液体培养基中37℃ 200rpm培养12h次划线CmRSpcRCmR抗性板验证Spc敏感性
263 突变株筛选
（1）挑取验证转化子30℃相应抗性THY培养基中培养活化
（2）1接种传代普通THY培养基中（含抗性）30℃培养12h
（3）次1接种传代普通THY培养基中（含抗性）40℃培养6~8h
（4）稀释适倍数（约10）涂布相应抗性板
（5）挑取步中获单克隆分点接单抗双抗板
（6）选取单抗生长双抗生长克隆次点接双抗板进行次验证
（7）验证正确提取基组进行PCR验证
（8）重复（3）（7）步骤直挑选出突变株
图 22 突变株筛选流程
Fig 22 Mutants screening process
27 重组菌验证
图23示成功发生双交换抗性基会插入目基中部功丧失目基游设计验证引物进行PCR验证时原目基10kb时会菌株具相应抗生素抗性
271 PCR验证
筛选出合适转化子提取基组验证引物p1p2进行PCR验证发生双交换目条带26kb未发生双交换目条带16kb进步验证否发生双交换引物p1p4p2p3进行PCR验证中p3p4抗性基引物发生双交换会出现相应目条带
图 23 双交换示意图
Fig 23 The doublecrossover diagram
272 抗性验证
正图23示发生双交换质粒丢失菌株会具相应抗生素抗性时菌株点接相应抗性板会正常生长野生型会种方更进步验证突变株
28 罐摇瓶发酵检测方法
281 发酵条件
5L发酵罐中进行发酵发酵培养基蔗糖50gL酪蛋白胨10gL酵母提取物35gLK2HPO4 2gLNaCl 15gLMgSO4·7H2O 04gL发酵条件：5L发酵液装液量3L接种量837℃pH70通气量3vvm发酵22h5MNaOH调节pH
282 HA含量检测
（1）样品预处理
4h6h样品取2ml等体积01SDS处理 10min8h22h样品取1ml1ml离子水稀释然2ml01SDS处理 10min1200rpm离心15min
取1ml清3倍体积水乙醇沉淀30min1200rpm离心10min清转移新10ml离心测定乳酸蔗糖沉淀2ml水乙醇洗涤遍
1200rpm离心10min弃清室温晾干4h样品4ml菌水溶解6h8h样品8ml菌水溶解10h22h样品10ml菌水溶解ＨＡ含量测定
283葡萄糖醛酸标曲制作
（1）精密称取葡萄糖醛酸20mg置100mL量瓶中加水溶解刻度摇匀备
（2）精密量取标准溶液05115225mL分加入10mL量瓶中加水稀释刻度1020304050ugmL浓度品溶液
（3）取6具刻度试分加入硼砂硫酸液5mL置冰浴中冷4℃左右（4）分取空白溶液(纯化水)浓度品溶液1mL加入试中先轻轻振摇充分混匀断冰浴冷
（5）试置沸水中加热10min置水中冷室温
（6）加入咔唑试剂02mL混匀水浴中加热15min冷室温
（7）530nm处测定吸光度A吸光度浓度c作图绘出标准曲线
284 样品测定
取样品溶液1mL标准曲线测定方法测定530nm吸光度标准曲线查出应葡萄糖醛酸浓度稀释倍数葡萄糖醛酸含量占整产量4643测葡萄糖醛酸含量4643HA产量
285分子量测定
取适量时发酵液等体积01SDS处理10min12000rmin离心15min取清3倍体积水乙醇沉淀30min12000rmin离心10min清沉淀乙醇盐溶液洗涤次室温晾干适量02MNaCl溶液溶解充分溶解045μm滤膜滤滤乌氏粘度计测出特性粘度改良咔唑法测出HA含量根公式计算出HA分子量具体步骤：
（1）测定出02M氯化钠溶液流出乌氏粘度计流出时间t0t0应167mim
（2）测定出时处理样品流出乌氏粘度计流出时间t1t1应介t01315倍间
（3）测定出时间样品HA含量c
（4）根公式计算出特性粘度η根特性粘度计算出分子量Mη公式式21：
式 21
286 蔗糖浓度检测
吸取测样品溶液09 mL(蔗糖含量应40250 mgL)01mL 2molL氢氧化钠然100℃沸水浴中加热10 min立流水中冷加入间苯二酚溶液1 mL 10molL盐酸3 mL摇匀置80℃水浴中加热8 min冷500 nm波长处空白调零测定样品吸光度标准样作求样品中蔗糖含量
287乳酸浓度测定
乳酸含量测定程中发酵时间样品稀释倍数相4h需稀释50倍6h24h稀释100倍测定时样品HA含量测定时沉淀HA时乙醇清液稀释倍数沉淀HA算起样品倍数稀释充分混匀采SBA40型生物传感分析仪（山东省科学院生物研究）测定乳酸产量次进样25μL乳酸产量公式22
式 22
29 总RNA提取
（1）液体培养基中生长菌体离心收集迅速放入液氮预冷研钵中次研磨粉末
（2）取50~100mg菌体放入预冷RNase污染离心中（121℃灭菌1h）迅速加入1ml Trizol试剂移液器吹匀漩涡振荡器振荡2min室温放置5min12000rpm 4℃离心10min
（3）移取清新离心中加入200μl酚200μl氯仿抽提充分剧烈混匀室温放置3min12000rpm 4℃离心15min
（4）移取清新离心中加入100μl酚100μl氯仿抽提充分剧烈混匀室温放置3min12000rpm 4℃离心15min（程重复次中间层）
（5）移取清新离心中加入200μl氯仿抽提充分剧烈混匀12000rpm 4℃离心10min
（6）移取清新离心中加入等体积异戊醇2倍体积水乙醇20℃70℃沉淀30min12000rpm 4℃离心10min
（7）弃清加入1ml 75乙醇洗涤两次（12000rpm 4℃离心2min）室温干燥加入适体积（50μl）DEPC水溶解70℃冻存甲酰胺溶解RNA沉淀贮存20℃（注意：RNA完全干燥否会降低溶解度）
（8）预先灭菌15琼脂糖凝胶加热凝固制胶放清水水乙醇处理晾干电泳槽中加入灭菌电泳液
（9）取2μl RNA置灭菌离心中计入RNA专loading buffer 2μl电泳30min
3 结果讨
31 hylZhylB氨基酸序列
Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中发现两种透明质酸酶基hylZhylBNBCI里接入号分 CP002904NC_011134核苷酸序列源性3585 hylZ基1695碱基中594碱基基hylB相(594bp1657bp)相 hylZ基1695碱基编码564氨基酸基hylB3192碱基前体基真正起作部分第604碱基开始编码869氨基酸残基
图31中出两种酶氨基酸序列源性1066两透明质酸酶氨基酸两完全相序列
图31 hylBhylZ氨基酸序列
Fig 31 Alignments of the amino acid sequence of hylB with ylZ
32 兽疫链球菌总RNA提取
进步研究hylBhylZ基否表达否活性两种透明质酸酶基链球菌身里RNA转录水进行研究首先兽疫链球菌中总RNA进行提取图32野生型兽疫链球菌中总RNA提取电泳图（a）（b）分清楚总RNA样品中DNA污染前电泳图出总RNA提取成功克隆肠杆菌Ecoli B L21中进行表达纯化通测定两种酶活性（数未列出）结果显示兽疫链球菌中透明质酸酶基hylZ肠杆菌Ecoli B L21克隆表达纯化未检测出活性种透明质酸酶基hylB克隆表达纯化降解HA活性高
图32 兽疫链球菌中总RNA提取
Fig 32 The total RNA extraction from Sequi subsp zooepidimicus ATCC 39920
（a）清DNA前总RNA电泳图12分两行样
（b）清DNA总RNA电泳图12分两行样
33 hylBhylZ基反转录
提取总RNA进行反转录前避免RNA中DNA污染影响反转录结果准确性首先DNA进行清验证否清干净反转录参三磷酸甘油醛脱氢酶引物：GAPDHF：TGCTTTCCGTCGTATCCAGAPDHR：CACCGTCAGTAGCCCAGT 进行验证图33a泳道12两组样品阴性泳道3阳性样品1样品2中泳道46分清DNA前PCR结果泳道57清DNAPCR验证结果PCR验证结果中出结总RNA样品1中DNA污染样品2中没清DNA均排DNA污染
(a)
(b)
图 33 hylBhylZ基反转录结果
Fig 33 The reverse transcription results of hylB and hylZ
（a）RNA样品中DNA污染清验证
12：两组样品阴性 3：阳性 46：清DNA前PCR结果
57：清DNAPCR验证结果
（b）：三磷酸甘油醛脱氢酶基RTPCR结果 hylB：透明质酸酶基hylB RTPCR结果hylZ：透明质酸酶基hylZ RTPCR结果
清DNA污染总RNA样品作反转录模板反转录试剂盒操作手册进行反转录获cDNAcDNA模板分引物GAPDHF：TGCTTTCCGTCGTATCCAGAPDHR：CACCGTCAGTAGC CCA GTHylZF：GGATCT GATCCAGCTTGCCAAGGAA HylZR ：CAGCAGG AATAGCC TC TG ATAACTC HylBF ：TTATCAGATTGCAGCGGAGTCCAGC HylBR：CAG GTAGCTGT CATATGAGACGATTG 进行PCR扩增反应程序：预变性4min变性30s退火1min延伸30s延伸5min35循环PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图33bRTPCR结果显示基hylZRNA转录水较高相反基hylB转录水低
34兽疫链球菌总DNA提取
研究根GeneBank中公布兽疫链球菌ATCC 35246透明质酸酶基序列进行目基PCR扩增基础设计PCR扩增引物培养收集足够兽疫链球菌菌体提取总DNAPCR方法扩增目基
图34 兽疫链球菌总DNA提取
Fig 34 Total DNA extracted from Streptococcus zoopidemics
兽疫链球菌菌体包裹着丰富粘糖物质菌液粘稠收集菌体时需发酵液稀释长时间离心提取DNA时需加入溶菌酶提取总DNA1琼脂糖凝胶电泳检测结果图34示图出提取DNA基完整杂质较少明显降解现象基PCR扩增
35透明质酸酶基hylB克隆
（1）hylB基片段PCR扩增
兽疫链球菌总DNA模板UPhylBDWhylB引物进行PCR扩增扩增产物1琼脂糖凝胶电泳结果图35示
图 35 PCR 扩增 hylB 基片段
Fig 35 Amplification gene of hylB by PCR
M：DNA marker 1：基hylB PCR 扩增产物
透明质酸酶基HylB总约25kb左右研究中采插入灭活基方法需左右源臂长度800bp左右设计引物扩增目条带1686bp图35中约16kb条清晰条带实验预期结果1686bp相符条带切胶回收步实验
（2）HylB基片段胶回收
采 TaKaRa Agarose Gel DNA purification kit hylB 基 PCR 产物进行回收纯化回收纯化电泳结果 PCR 扩增目基产物电泳结果
（3）hylB基PCR产物pSET4S载体酶切连接转化
获 hylB 基片段 pSET4S 载体分进行Pst IBamH I 双酶切酶切产物回收加入 T4 连接酶16℃夜连接然转化肠杆菌感受态助壮观霉素抗性筛选阳性克隆子
（4利菌落PCR检测肠杆菌转化子
壮观霉素抗性板挑取单菌落进行菌落PCR扩增电泳结果显示检测肠杆菌转化子16kb左右出现亮条带扩增出片段吻合结果图36初步证明hylB基片段连接pSET4S 载体
图 36转化子菌落 PCR 结果
Fig 36 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker12：转化子菌落 PCR 验证
（5） 重组质粒酶切验证
选择PCR验证阳性转化子进行培养提取质粒质粒切酶Pst IBamH I 双酶切进行重组质粒验证理应4605 bp1686 bp条带图37中出验证结果理致说明目片段已连pSET4S载体结果图37
图 37重组质粒酶切验证
Fig 37 Digested verification of recombinant plasmid
M：DNA marker12 质粒BamHⅠPstⅠ酶切条带
36透明质酸酶基hylZ克隆
（1）兽疫链球菌总DNA模板UPhylZDWhylZ引物进行PCR扩增扩增产物1琼脂糖凝胶电泳结果图38示
图 38 PCR 扩增 hylZ 基片段
Fig 38 Amplification of hylZ by PCR
M：DNA marker 1：hylZ 基 PCR 扩增产物
图38中约16 kb条清晰条带实验预期结果1600 bp符步连接转化
（2）hylZ基片段胶回收
采 TaKaRa Agarose Gel DNA purification kit hylZ 基 PCR 产物进行回收纯化回收纯化电泳结果 PCR 扩增目基产物电泳结果
（3）hylZ基PCR产物批pSET4S载体酶切连接转化
获 hylZ基片段 pSET4S 载体分进行Pst IBamH I 双酶切酶
切产物回收加入 T4 连接酶16℃夜连接然转化肠杆菌感受态助壮观霉素抗性筛选阳性克隆子
（4） 利菌落PCR检测肠杆菌转化子
图39转化子菌落 PCR 结果
Fig 39 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 验证
(5) 重组质粒酶切验证
选择PCR验证阳性转化子进行培养提取质粒质粒切酶Pst IBamH I双酶切进行重组质粒验证结果图310酶切结果验证正确步实验
图 310重组质粒酶切验证
Fig 310 Digested verification of recombinant plasmid
M：DNA marker12 质粒BamHⅠPstⅠ酶切条带
37 基敲载体pSET4ScmrpSET4Skana构建
371基敲载体pSET4Scmr构建
（1）氯霉素抗性基PCR扩增
根质粒氯霉素（cmr）抗性基序列引引物CMUP CMDWPCR扩增氯霉素（cmr）抗性基完整阅读框
图311 PCR扩增氯霉素基
Fig 311 Amplification of chloroamphenicol gene by PCR
M：DNA marker1~3：氯霉素基 PCR 产物
切胶回收目片段
（2）氯霉素基连接转化
切酶DraⅢ单酶切已连接hylB基pSET4S质粒磷酸化处理加入T4连接酶16℃连接夜混合体系转化肠杆菌感受态助氯霉素抗性筛选阳性克隆子
（3）利菌落PCR检测肠杆菌转化子
UPhylBDWhylB引物组合进行PCR扩增理应该约27 kb条带图312结果预期致验证正确步实验
图312转化子菌落 PCR 结果
Fig 312 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 产物
（4） 重组质粒提取酶切验证
选择扩增27 kb片段转化子进行培养采肠杆菌质粒提取方法PCR检测阳性肠杆菌阳性转化子进行质粒提取电泳检测图313示质粒提取Pst IBamH I 酶切进行重组质粒鉴定结果图313示
（a） （b）
图 313重组质粒 pSET4Scmr 提取酶切验证
Fig 313 The detection and digested verification of recombinant plasmid in Ecoli
（a）重组质粒 pSET4ScmrM： DNA ladder marker1~2：重组质粒 pSET4Scmr
（b）重组质粒 pSET4Scmr酶切验证M：DNA marker 1：BamHI Pst I酶切验证结果
电泳图313知提取质粒分子量72 kb左右利Pst IBamH I 酶切重组质粒通电泳凝胶检测26 kb左右出现见电泳条带扩增出片段相符合表明氯霉素抗性基已成功插入载体位目基中部证明基敲载pSET4Scmr构建成功
372基敲载体pSET4Skana构建
（1）卡霉素抗性基PCR扩增
根质粒卡霉素（kana）抗性基序列引引物KANAFKANARPCR扩增卡霉素（kana）抗性基完整阅读框图314
图314 PCR扩增卡霉素基
Fig314 Amplification of kanamycin gene by PCR
M：DNA marker1~3：卡霉素基 PCR 产物
切胶回收目片段
（2）卡霉素基连接转化
切酶DraⅢ单酶切已连接hylB基pSET4S质粒磷酸化处理加入T4连接酶16℃连接夜混合体系转化肠杆菌感受态助卡霉素抗性筛选阳性克隆子
（5）利菌落PCR检测肠杆菌转化子
UPhylZDWhylZ引物组合进行PCR扩增理应该约28 kb条带图315结果预期致
图315转化子菌落 PCR 结果
Fig 315 The identification of transformants by colony PCR
M：DNA marker1~3：转化子菌落 PCR 产物
（6） 重组质粒提取酶切验证
选择扩增27 kb片段转化子进行培养采肠杆菌质粒提取方法PCR检测阳性肠杆菌阳性转化子进行质粒提取电泳检测图316（a）示质粒提取Pst IBamH I 酶切进行重组质粒鉴定结果图316（b）
（a） （b）
图 316重组质粒 pSET4Skana 提取酶切验证
Fig316 The detection and digested verification of recombinants plasmid in Ecoli
（a）重组质粒 pSET4Skana 提取M： DNA ladder marker12：重组质粒 pSET4Skana （b）酶切验证M：DNA marker 12：BamHI Pst I酶切验证结果
图316知提取质粒分子量72 kb左右利Pst IBamH I 酶切重组质粒通电泳凝胶检测
27kb左右出现见电泳条带扩增出片段相符合表明氯霉素抗性基已成功插入载体位目基中间表明基敲载pSET4Skana构建成功
38敲载体转化转化子验证
381 pSET4Scmr敲载体转化转化子验证
野生型兽疫链球菌ATCC 39920敲载体pSET4Scmr混匀电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图317
图317 pSET4Scmr载体电转转化子
Fig317 The transformat of pSET4Scmr vecter
兽疫链球菌革兰氏阳性菌株带较厚荚膜菌落形态图317示圆润透明
挑取定量转化子点接cmrspcr双抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选出cmr单抗板生长cmrspcr双抗性板生长单克隆提取基组进行PCR验证终六株阳性克隆140克隆中10株阳性克隆双交换概率约7
图 318 突变株PCR验证示意图
Fig 318 PCR validation diagram of mutants
发生双交换引物组p1p2p1p4p2p3进行验证分会出现2746bp 2171 bp 2130bp条带图319P1引物序列GCGGTTGGTTGATG ACCTGACGP2引物学列CAATCGGCAAATCAAAGTGGTGP3引物序列 GTGACACAATGTGTCCCCTGGATACCGCTCGP4引物序列GAGTCACATTG TGGAACCCCAGAGTCCCGC
（a） （b）
图319阳性克隆PCR验证
Fig319 The identification of positive transformants by PCR
（a）引物组p1p2验证M：DNA marker1：WT2~3：阳性克隆
（b）引物组p1p4p2p3验证M：DNA marker1：p1p42：p2p3
电泳图出引物组p1p2p1p4p2p3分阳性克隆PCR验证时结果预期相符初步判断获需转化子进步验证转化子正确性获突变株画线接种形影抗性板观察生长情况
382 pSET4Skana敲载体转化转化子验证
野生型兽疫链球菌ATCC39920敲载体pSET4Skana电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图320
图320 pSET4Skana载体电转转化子
Fig320 The transformats of pSET4Skana vecter
挑取定量转化子点接cmrspcr双抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选120克隆中获6株cmr单抗性板生长cmrspcr双抗性板生长菌株6株菌接种带cmr抗性THY培养基中培养提取基组验引物进行PCR验证验证结果图321
图321验证引物组p1p2阳性克隆PCR验证
Fig321 The identification of positive transformants by primer p1p2
M：DNA marker1：阴性2：WT4~8：阳性克隆
示意图示发生双交换时基组左臂更左约200bp右臂更右约200bp位置设计验证引物组进行PCR验证时会出现34kb左右条带野生型没外源抗性基插入会原基组应约27kb
图321结果出阳性克隆PCR克隆条带结果理相符初步判断获索突变株
更进步验证阳性转化子正确性选插入透明质酸酶基中部抗性基引物p3p4验证引物p1p2进行组合PCR方法更准确确认双交换发生PCR验证结果图322
图322 验证引物组p1p4p2p3阳性克隆PCR验证
Fig 322 The identification of positive transformants by primer p1p4p2p3
M：DNA marker13：引物组p1p424：引物组p2p3
图315示发生双交换时引物组合p1p4p2p3PCR扩会约23kb21kb条带图322出目条带理致进步证明阳性转化子正确性
383双敲转化验证
双敲转化子已敲透明质酸酶基hylZ基础hylB基进行敲敲载体pSET4Scmr已敲hylZ突变菌株ΔHylZ混匀电转化含8 μgmL壮观霉素抗性板培养48h72h形成透亮菌落图323
图323 pSET4Scmr载体电转转化子
Fig323 The transformat of pSET4Scmr vecter
挑取定量转化子点接cmrspcr三种抗性板确保敲载体转化进 入野生型兽疫链球菌ATCC39920中挑取cmrspcr双抗板生长菌落进行传代培养262方法进行筛选
筛选50克隆中获3株cmr单抗性板生长cmrspcr双抗性板生长菌株5株菌接种带cmr抗性THY培养基中培养提取基组验证引物进行PCR验证验证结果：
图324验证引物组p1p2阳性克隆PCR验证
Fig 324 The identification of positive transformant by PCR
M：DNA marker1：WT2~4：双敲阳性克隆
验证引物p1p2野生型WT够扩增出22kb条带发生双交换突变株够扩增出33kb条带图324结果证明成功获突变株
384阳性克隆抗性验证
进步验证转化子正确性观察突变株野生型相否形态变化获三种突变株野生型抗性THY固体培养基进行进行画线培养图322出突变株形态没明显改变突变株带抗性基抗性培养基会表现出生长状态图325示
带抗性培养基野生型WT三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB会生长（图 325a）kana抗性培养基突变株ΔHylZΔHylZB会生长野生型WT突变株ΔHylB会生长（图 325b）样cmr抗性板WTΔHylZ会生长ΔHylBΔHylZB会生长（图 325c）kanacmr双抗行板双敲菌株ΔHylZB够正常生长（图 325d）实验结果相符进步证明突变株正确性
图325阳性转化子抗性验证抗
Fig 325 The resistance verification of positive transformants
（a）抗性THY固体培养基 （b）kana抗性THY固体培养基
（c）cmr抗性THY固体培养基 （d）kanacmr双抗性THY固体培养基
39 透明质酸酶基hylBhylZ菌株代谢影响
透明质酸合成高耗程定灭活相关透明质酸酶基理会菌株代谢产物产生影响文通5L发酵罐中采发酵培养基控制发酵条件温度37℃pH值70通气量3vvm搅拌转速300rmin发酵22h
测定生长曲线HAHA分子量蔗糖乳酸等相关代谢产物否确定透明质酸酶基代谢影响
391生长曲线测定
5L发酵罐中进行发酵时产生丰富HA时菌体会量繁殖致发酵液非常粘稠法直接测定660nm吸光值必须发酵液进行稀释具体方法准确吸取1mL发酵液试中移液准确量取9mL菌水加入试中稀释十倍充分混匀660nm测定吸光值测定结果图326示生长曲线中出曲线基呈S型前4h处停滞期4h10h进入数生长期期间明显观察菌体迅速繁殖代谢产物剧烈增加6h时发酵液已变粘稠10h发酵液相已粘稠进入稳定期野生型三种突变株生长状况基相没显著差异
图326 兽疫链球菌WT三种突变株生长曲线
Fig 326 The growth curves of WT and its mutants
392 HA产量测定
HA产量测定方法采改良咔唑法理讲果两种透明质酸酶hylBhylZ基兽疫链球菌ATCC 39920表达活性话基进行灭活成功时会体现出HA产量提高测定结果图327出突变株野生型HA产量基相没明显差原导致：①两种酶基未表达②两种酶基表达兽疫链球菌里没活性③两种酶基表达表达量低粘稠发酵液中起作微微
图327兽疫链球菌WT三种突变株HA产量
Fig 327 The HA production of WT and its mutants
393 HA分子量测定
文通测定特性粘度方法测定透明质酸分子量分子量处理溶液浓度乌氏粘度计流出时间关浓度越流出时间更长时分子量越样原理两透明质酸酶基hylBhylZ基表达活性时理HA分子量会增图328出野生株WT突变株ΔHylZ发酵产生HA分子量基相似突变株ΔHylB双敲突变株ΔHylZB发酵产生HA分子量基相似前两种菌株WT突变株ΔHylZ8h相差时野生株WT产HA分子量191×106双敲菌株ΔHylZB产HA分子量211×106高出15
图328兽疫链球菌WT三种突变株HA分子量
Fig 328 The HA MW of WT and its mutants
394 蔗糖测定
兽疫链球菌发酵产HA高耗程糖类提供量源文发酵程中采蔗糖作碳源测定消耗程定程度反映野生菌株突变株代谢方面否差图329发现糖原利方面然突变株ΔHylBΔHylZB耗糖速度突变株ΔHylZ野生型ΔWT快差距明显利糖趋势基相进入数期蔗糖含量急剧降发酵20h蔗糖已基倍消耗干净值发酵22h便停止发酵原
图329糖消耗程曲线图
Fig 329 Kinetics of sugar comsuption in fermentation process
395 乳酸测定
HA 合成前体 1P葡萄糖UDP葡萄糖 UDPN乙酰氨基葡萄糖胺时合成细胞壁(约占细胞干重 20ww) HA 合成细胞生长间存着碳源竞争关系兽疫链球菌发酵生产 HA 重代谢特性时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产途径)代谢产物乳酸乳酸细胞生长 HA 合成较强抑制作效转变细胞产途径降低乳酸细胞生长HA合成抑制作提高整发酵程生产强度生产效率具重意义
兽疫链球菌产透明质酸高耗程合成1mol HA需3mol ATP图16乳酸产生成菌株量代谢程密切相关测定三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT乳酸产量定程度反映出两种透明质酸酶基定插入灭活否量代谢产生影响图330出
三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT乳酸产量方面没差说明两种透明质酸酶基量代谢程没影响
图330产乳酸程曲线图
Fig 330 Kinetics oflactic acid in fermentation process
4 结
实验成功Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中两种透明质酸酶基hylBhylZ进行基敲初步研究两种基失活HA产量分子量相关代谢产物代谢影响Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920发酵生产HA 具定理实际应意义
（1）Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920中发现两种够降解HA透明质酸酶基hylBhylZ序列显示两种完全透明质酸酶
（2）提取Sequi subsp Zooepidimicus ATCC 39920总RNA进行RTPCR反转录实验结果显示两种透明质酸酶基会表达基hylB转录水低基hylZ转录水高
（3）成功获三种突变菌株：敲透明质酸酶基hylZ突变株ΔHylZ敲透明质酸酶基hylB突变株ΔHylB时敲hylBhylZ两基突变株ΔHylZB
（4）三种突变株ΔHylZΔHylBΔHylZB野生型WT菌株进行罐发酵检测结果显示突变株野生型菌体生长HA产量糖原消耗速率乳酸产量均没明显差异说明透明质酸酶基hylZhylB四方面没显著影响分子量突变株ΔHylBΔHylZB相突变株ΔHylZ野生型WT15
（5）两种透明质酸酶基HA分子量较影响发酵条件酶作条件适条件两种酶基转录差异两种酶表达否具透明质酸酶活性造成两种酶活性进步研究
5 展
年细菌性源透明质酸酶研究越越类酶基结构降解机制生化性质应领域等更深刻认识时步研究应提供方应该许方面需进步研究予证实透明质酸降解方细菌源透明质酸酶适反应条件酶活性检测方法探索改进等相信着研究记忆深入类基时代透明质酸酶特性越越发现时透明质酸身研究应进步促进作预防治疗透明质酸酶相关疾病提供新途径理
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7 攻读硕士研究生学位期间发表文情况
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[2] 王洋洋王震希宏刘浩．三株药乳杆菌生理生化特征研究[J]．安徽农业科学201341(8)：33103313
8 致 谢
三年研究生生活渐入尾声三年中发生令难忘怀事谨关心帮助表示衷心感谢
文导师刘浩教授悉心指导完成刘老师广博专业知识精益求精工作作风严谨治学态度获益匪浅接受全新思想观念树立远学术目标领会基研究方法课题选题实验方案设计实验进行直文撰写程中刘老师热心帮助力支持整实验进行中困难重重刘老师次予耐心指导精辟意见精神备受鼓舞够克服困难继续前行刘老师表示衷感谢
两年学科研中时感谢希宏老师张健老师研究生期间予亲切指导帮助真诚感谢实验室杨进李孙芳等私帮助外11级研究生12级研究生试验完成予少协助表示衷心感谢
衷心感谢物质精神始终支持家朋友表示诚挚谢意
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