血液制品灭活病毒技术方法
目前已知血液制品传染病毒HBVHCVHIV1HIV2HTLV细病毒B19尚未发现血液制品传染CJD少数研究报告发现实验性传染现象密切关注CJD特vCJD发展动
提高血液制品安全性生产工艺具定灭活部分病毒力生产程中应特定灭活病毒方法技术指导原血液制品（指血浆原料制备制品）生产程特定灭活病毒方法验证指导原包括指示病毒病毒灭活方法选择验证方案设计结果判定附录列技术验证申报程序
灭活病毒方法选择
类血液制品潜污染病毒性选择病毒灭活方法侧重点应：
（）凝血子类制品
生产程中应特定灭活脂包膜非脂包膜病毒方法采种种方法联合灭活病毒
（二）免疫球蛋白类制品
免疫球蛋白类制品（包括静脉注射免疫球蛋白免疫球蛋白特异性免
疫球蛋白）生产程中应特定灭活脂包膜病毒方法进步提高类制品安全性考虑提倡生产程中加入特定针非脂包膜病毒灭活方法
（三）白蛋白
采低温乙醇生产工艺特定灭活病毒方法巴斯德消毒法等
二常灭活病毒方法评价
（）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）
1．血白蛋白制品
十年床应结果表明白蛋白巴氏消毒法HIV肝炎病毒安全病毒
灭活条件已完善求进行病毒灭活验证必须巴氏消毒法设施进行验证巴氏消毒参数符合求（包括制品温度分布均性灭活时间）
2．血液制品（液体制剂）
制品组成稳定剂（：氨基酸糖枸橼酸盐等）浓度均会
灭活病毒效果定影响采巴氏消毒灭活病毒方法时必须进行病毒灭活效果验证
（二）干热法（冻干制品）
80℃加热72时灭活HBVHCVHIVHAV等病毒应考虑制品水分
含量制品组成（：蛋白质糖盐氨基酸）病毒灭活效果影响应确定允许制品瓶间参数差异病毒灭活干热箱少半年验证次验证时干燥箱应设测温点（包括制品箱高低温度点）
（三）机溶剂污剂（SD）处理法
机溶剂：磷酸三丁脂（TNBP）非离子化污剂：Triton X100吐温
80结合灭活脂包膜病毒非脂包膜病毒效常灭活条件03TNBP1吐温8024℃处理少6时03TNBP1Triton X10024℃处理少4
时SD处理前应先1μm滤器蛋白溶液中存颗粒（颗粒藏匿病毒
影响病毒灭活效果）加入SD应确保均混合物灭活病毒全程中应温度控制规定范围果加入SD滤须检测滤SD浓度否发生变
化变化应进行适调整吐温80应采植物源性应采称量法量取
（四）膜滤法
膜滤技术滤膜孔径病毒效直径时效病毒该方法单
独应方法联合
验证研究时应考虑蛋白溶液浓度滤速压力滤量等重参数滤前
滤应测试滤膜完整性
（五）低pH孵放法
研究表明免疫球蛋白生产工艺中低pH（pH4）处理（时加胃酶）灭活种
脂包膜病毒灭活条件（：pH值孵放时间温度胃酶含量蛋白质浓度溶质含量等素）影响病毒灭活效果验证试验应该研究参数允许变化幅度
三特定灭活病毒方法验证
（）指示病毒选择
首先应该选择血液传播相关病毒（：HIV）相关病毒选择理化性质相似指示病毒第二选择病毒理化性质应代表性（病毒核酸类型包膜）中少应包括种物理化学处理明显抗性病毒进行灭活病毒验证时应根制品特性采病毒灭活工艺参表列举病毒选择适宜指示病毒选择指示病毒少应包括HIV1HBVHCV
模拟病毒非脂包膜病毒水疱性口炎病毒（VSV）耐受pH范围较广验证低pH孵放法灭活病毒效果时选指示病毒
血液传播疾病相关病毒验证选指示病毒（举例）
┌──┬───┬───┬──────┬──────────────┐
│病毒│基组│脂包膜│（nrn） │ 指示病毒举例 │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│HIV │ RNA │ │ 80100 │ HIV │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│HBV │ DNA │ │ 45 │鸭乙型肝炎病毒伪狂犬病毒 │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│HCV │ RNA │ │ 4060 │牛腹泻病毒Sindbis病毒 │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│HAV │ RNA │ │ 27 │HAV脊髓灰质炎病毒脑心肌 │
│ │ │ │ │炎（EMC）病毒 │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│B19 │ DNA │ │ 20 │犬细病毒猪细病毒 │
└──┴───┴───┴──────┴──────────────┘
（二）方案设计
1．灭活病毒验证研究应符合GLP求
2．研究影响灭活病毒效果参数（包括机械参数理化参数）允许变化幅度
3．研究病毒灭活动力学包括病毒灭活速率灭活曲线
4．指示病毒滴度应该高（病毒滴度应≥106ml）
5．加入病毒验证样品体积高1∶9
6．验证程中步取出样品应快直接进行病毒滴定做进步处理（超离心透析保存抑制剂毒性物质等）果样品必须做进步处理时间取出样品时间进行测定应考虑处理方法病毒检测结果影响
7．检测方法包括蚀斑形成细胞病变（合胞体病灶形成）终点滴定方法方法应该适宜灵敏度重复性取样点应取双份样品设保证结果准确性
8．果制品生产工艺中包含两步两步病毒灭活方法应该分进行
病毒灭活效果验证
（三）观察指标
1．病毒方面
（1）灭活病毒滴度
（2）灭活病毒速率灭活曲线列表做图形式报告验证结果
2．病毒灭活参数允许变化范围
3．蛋白质方面
（1）制品质量应符合中国生物制品规程关规定
（2）采适方法测定蛋白质结构功活性变化：制品活性IVIGFc
功分析解蛋白质结构否发生变化凝胶色谱法检测蛋白质分子形状变化蛋白质形状变化导致扩散系数沉降常数粘度改变SDSPAGE特等电聚焦PAGE结合（双电泳）检测蛋白质结构变化方法
（3）果采新灭活方法（包括更换已认病毒灭活方法国外未
采病毒灭活方法）需蛋白质半衰期新免疫原性进行研究求：
半衰期：适宜动物（鼠家兔）未病毒灭活相制品进行半衰期较
新免疫原性：新免疫原性检查蛋白质较高级结构变化变化定损
害蛋白质功会引起受体免疫反应实验室检测新免疫原性非常困难未病毒灭活蛋白分免疫动物（家兔）产生抗体交叉未病毒灭活蛋白结合果病毒灭活蛋白抗体未病毒灭活蛋白完全结合说明含新抗原保证类免疫系统识表位实验动物相推荐Ⅳ期床（获生产文号）开展否新抗原产生研究
（四）效果判定
判断病毒灭活效性须综合考虑仅病毒灭活量确定确
定效前必须考虑素审慎评价次验证结果
1．验证试验选择病毒否适宜病毒验证设计否合理
2．病毒降低量（log10）≥4 logs表示该步骤灭活病毒效检测方法造成
病毒降低量＜4 logs时应盲传三代病毒检出认定效灭活病毒方法
3．病毒灭活动力学更显示病毒灭活效果病毒灭活通常简单级反应起始反应速率快变慢果病毒灭活速率时间明显降低表示该方法效者残留指示病毒该灭活方法抵抗力说明该步病毒灭活方法效
4．病毒实际滴度基础病毒指示病毒样品19例混匀零点取样病毒滴度通灭活病毒测定实际病毒残留量较作该病毒灭活方法（步骤）实际灭活病毒量
5．病毒检测敏感度限值
举例说明：
（1）加入6 logs 病毒剩余4 logs 病毒灭活病毒log数计算生产全
程中灭活病毒总量中步（方法）灭活病毒力言效
（2）加入6 logs 病毒制品身细胞毒作检测灵敏度限值4 logs
仅证明2 logs 病毒种情况需改变试验设计重新进行验证
（3）加入6 logs 病毒测定2 logs 剩余病毒清病毒量重复出
受工艺影响应认效灭活病毒方法
（4）加入 6 logs病毒 未检测出病毒检测灵敏度限值2 logs 仅
认约清灭活4 logs 病毒事实等4 logs 应判定方法
清病毒量≥4 logs
（5）病毒灭活动力学非常重观察指标巴氏消毒法（60℃10时）果病毒残留量快降低检出限度值说明方法灭活病毒效果果病毒灭活速率缓慢灭活结束时达低检出限度值认效病毒灭活方法说评价验证结果仅考虑病毒降低量时考虑病毒灭活动力学
四生产工艺灭活病毒力验证
生产工艺灭活病毒力验证参特定灭活病毒方法验证求进行需
特殊考虑问题方面：
（）灭活病毒作生产步骤进行验证
（二）模拟生产工艺种参数应实际生产工艺相致pH温度蛋白质组成成分浓度反应时间层析柱柱床高度流速床高例洗脱图谱该步骤生产效果（产量活性组成成分）应分析生产工艺中种参数偏差病毒灭活效果影响
（三）生产步骤类型病毒灭活选择性
（四）核酸扩增技术（PCR）检测病毒核酸灵敏度较高该检测技术
局限性区灭活未灭活病毒该技术灭活病毒量验证生产程中病毒量验证
（五）通常生产程中灭活病毒量计算清病毒总量中认定
效病毒步骤生产程通常变化难控制验证病毒分配完全取决病毒特异理化性质理化性质影响病毒凝胶介质相互作沉淀性质病毒表面特性微差异（：糖基化）指示病毒靶病毒分配形式完全实验室增殖相关病毒分配野生株然果病毒降低量重复果影响病毒分配生产参数适确定控制组份般公认含病毒组份分开符合效步骤标准（认效灭活病毒步骤）
（六）验证目确定生产工艺灭活病毒力获生产全程中估计灭活病毒总量般降低总量步降低病毒量总病毒验证局限性分步骤中病毒降低量≤1 log应计算总量中
五灭活病毒方法验证
种情况需进行病毒灭活方法验证：
（）首次生产者需生产工艺中特定灭活病毒方法进行验证
（二）采新工艺原生产工艺进行重改革时需生产工艺进行清病毒
力验证特定灭活病毒方法进行灭活病毒效果验证
（三）工艺改变属重工艺改革时需特定灭活病毒方法进行验证
（四）灭活中间品组成成分pH值发生改变时需特定灭活病毒方法
进行验证
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目前已知血液制品传染病毒HBVHCVHIV1HIV2HTLV细病毒B19尚未发现血液制品传染CJD少数研究报告发现实验性传染现象密切关注CJD特vCJD发展动
提高血液制品安全性生产工艺具定灭活部分病毒力生产程中应特定灭活病毒方法技术指导原血液制品（指血浆原料制备制品）生产程特定灭活病毒方法验证指导原包括指示病毒病毒灭活方法选择验证方案设计结果判定附录列技术验证申报程序
灭活病毒方法选择
类血液制品潜污染病毒性选择病毒灭活方法侧重点应：
（）凝血子类制品
生产程中应特定灭活脂包膜非脂包膜病毒方法采种种方法联合灭活病毒
（二）免疫球蛋白类制品
免疫球蛋白类制品（包括静脉注射免疫球蛋白免疫球蛋白特异性免
疫球蛋白）生产程中应特定灭活脂包膜病毒方法进步提高类制品安全性考虑提倡生产程中加入特定针非脂包膜病毒灭活方法
（三）白蛋白
采低温乙醇生产工艺特定灭活病毒方法巴斯德消毒法等
二常灭活病毒方法评价
（）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）
1．血白蛋白制品
十年床应结果表明白蛋白巴氏消毒法HIV肝炎病毒安全病毒
灭活条件已完善求进行病毒灭活验证必须巴氏消毒法设施进行验证巴氏消毒参数符合求（包括制品温度分布均性灭活时间）
2．血液制品（液体制剂）
制品组成稳定剂（：氨基酸糖枸橼酸盐等）浓度均会
灭活病毒效果定影响采巴氏消毒灭活病毒方法时必须进行病毒灭活效果验证
（二）干热法（冻干制品）
80℃加热72时灭活HBVHCVHIVHAV等病毒应考虑制品水分
含量制品组成（：蛋白质糖盐氨基酸）病毒灭活效果影响应确定允许制品瓶间参数差异病毒灭活干热箱少半年验证次验证时干燥箱应设测温点（包括制品箱高低温度点）
（三）机溶剂污剂（SD）处理法
机溶剂：磷酸三丁脂（TNBP）非离子化污剂：Triton X100吐温
80结合灭活脂包膜病毒非脂包膜病毒效常灭活条件03TNBP1吐温8024℃处理少6时03TNBP1Triton X10024℃处理少4
时SD处理前应先1μm滤器蛋白溶液中存颗粒（颗粒藏匿病毒
影响病毒灭活效果）加入SD应确保均混合物灭活病毒全程中应温度控制规定范围果加入SD滤须检测滤SD浓度否发生变
化变化应进行适调整吐温80应采植物源性应采称量法量取
（四）膜滤法
膜滤技术滤膜孔径病毒效直径时效病毒该方法单
独应方法联合
验证研究时应考虑蛋白溶液浓度滤速压力滤量等重参数滤前
滤应测试滤膜完整性
（五）低pH孵放法
研究表明免疫球蛋白生产工艺中低pH（pH4）处理（时加胃酶）灭活种
脂包膜病毒灭活条件（：pH值孵放时间温度胃酶含量蛋白质浓度溶质含量等素）影响病毒灭活效果验证试验应该研究参数允许变化幅度
三特定灭活病毒方法验证
（）指示病毒选择
首先应该选择血液传播相关病毒（：HIV）相关病毒选择理化性质相似指示病毒第二选择病毒理化性质应代表性（病毒核酸类型包膜）中少应包括种物理化学处理明显抗性病毒进行灭活病毒验证时应根制品特性采病毒灭活工艺参表列举病毒选择适宜指示病毒选择指示病毒少应包括HIV1HBVHCV
模拟病毒非脂包膜病毒水疱性口炎病毒（VSV）耐受pH范围较广验证低pH孵放法灭活病毒效果时选指示病毒
血液传播疾病相关病毒验证选指示病毒（举例）
┌──┬───┬───┬──────┬──────────────┐
│病毒│基组│脂包膜│（nrn） │ 指示病毒举例 │
├──┼───┼───┼──────┼──────────────┤
│HIV │ RNA │ │ 80100 │ HIV │
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│HBV │ DNA │ │ 45 │鸭乙型肝炎病毒伪狂犬病毒 │
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│HCV │ RNA │ │ 4060 │牛腹泻病毒Sindbis病毒 │
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│HAV │ RNA │ │ 27 │HAV脊髓灰质炎病毒脑心肌 │
│ │ │ │ │炎（EMC）病毒 │
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│B19 │ DNA │ │ 20 │犬细病毒猪细病毒 │
└──┴───┴───┴──────┴──────────────┘
（二）方案设计
1．灭活病毒验证研究应符合GLP求
2．研究影响灭活病毒效果参数（包括机械参数理化参数）允许变化幅度
3．研究病毒灭活动力学包括病毒灭活速率灭活曲线
4．指示病毒滴度应该高（病毒滴度应≥106ml）
5．加入病毒验证样品体积高1∶9
6．验证程中步取出样品应快直接进行病毒滴定做进步处理（超离心透析保存抑制剂毒性物质等）果样品必须做进步处理时间取出样品时间进行测定应考虑处理方法病毒检测结果影响
7．检测方法包括蚀斑形成细胞病变（合胞体病灶形成）终点滴定方法方法应该适宜灵敏度重复性取样点应取双份样品设保证结果准确性
8．果制品生产工艺中包含两步两步病毒灭活方法应该分进行
病毒灭活效果验证
（三）观察指标
1．病毒方面
（1）灭活病毒滴度
（2）灭活病毒速率灭活曲线列表做图形式报告验证结果
2．病毒灭活参数允许变化范围
3．蛋白质方面
（1）制品质量应符合中国生物制品规程关规定
（2）采适方法测定蛋白质结构功活性变化：制品活性IVIGFc
功分析解蛋白质结构否发生变化凝胶色谱法检测蛋白质分子形状变化蛋白质形状变化导致扩散系数沉降常数粘度改变SDSPAGE特等电聚焦PAGE结合（双电泳）检测蛋白质结构变化方法
（3）果采新灭活方法（包括更换已认病毒灭活方法国外未
采病毒灭活方法）需蛋白质半衰期新免疫原性进行研究求：
半衰期：适宜动物（鼠家兔）未病毒灭活相制品进行半衰期较
新免疫原性：新免疫原性检查蛋白质较高级结构变化变化定损
害蛋白质功会引起受体免疫反应实验室检测新免疫原性非常困难未病毒灭活蛋白分免疫动物（家兔）产生抗体交叉未病毒灭活蛋白结合果病毒灭活蛋白抗体未病毒灭活蛋白完全结合说明含新抗原保证类免疫系统识表位实验动物相推荐Ⅳ期床（获生产文号）开展否新抗原产生研究
（四）效果判定
判断病毒灭活效性须综合考虑仅病毒灭活量确定确
定效前必须考虑素审慎评价次验证结果
1．验证试验选择病毒否适宜病毒验证设计否合理
2．病毒降低量（log10）≥4 logs表示该步骤灭活病毒效检测方法造成
病毒降低量＜4 logs时应盲传三代病毒检出认定效灭活病毒方法
3．病毒灭活动力学更显示病毒灭活效果病毒灭活通常简单级反应起始反应速率快变慢果病毒灭活速率时间明显降低表示该方法效者残留指示病毒该灭活方法抵抗力说明该步病毒灭活方法效
4．病毒实际滴度基础病毒指示病毒样品19例混匀零点取样病毒滴度通灭活病毒测定实际病毒残留量较作该病毒灭活方法（步骤）实际灭活病毒量
5．病毒检测敏感度限值
举例说明：
（1）加入6 logs 病毒剩余4 logs 病毒灭活病毒log数计算生产全
程中灭活病毒总量中步（方法）灭活病毒力言效
（2）加入6 logs 病毒制品身细胞毒作检测灵敏度限值4 logs
仅证明2 logs 病毒种情况需改变试验设计重新进行验证
（3）加入6 logs 病毒测定2 logs 剩余病毒清病毒量重复出
受工艺影响应认效灭活病毒方法
（4）加入 6 logs病毒 未检测出病毒检测灵敏度限值2 logs 仅
认约清灭活4 logs 病毒事实等4 logs 应判定方法
清病毒量≥4 logs
（5）病毒灭活动力学非常重观察指标巴氏消毒法（60℃10时）果病毒残留量快降低检出限度值说明方法灭活病毒效果果病毒灭活速率缓慢灭活结束时达低检出限度值认效病毒灭活方法说评价验证结果仅考虑病毒降低量时考虑病毒灭活动力学
四生产工艺灭活病毒力验证
生产工艺灭活病毒力验证参特定灭活病毒方法验证求进行需
特殊考虑问题方面：
（）灭活病毒作生产步骤进行验证
（二）模拟生产工艺种参数应实际生产工艺相致pH温度蛋白质组成成分浓度反应时间层析柱柱床高度流速床高例洗脱图谱该步骤生产效果（产量活性组成成分）应分析生产工艺中种参数偏差病毒灭活效果影响
（三）生产步骤类型病毒灭活选择性
（四）核酸扩增技术（PCR）检测病毒核酸灵敏度较高该检测技术
局限性区灭活未灭活病毒该技术灭活病毒量验证生产程中病毒量验证
（五）通常生产程中灭活病毒量计算清病毒总量中认定
效病毒步骤生产程通常变化难控制验证病毒分配完全取决病毒特异理化性质理化性质影响病毒凝胶介质相互作沉淀性质病毒表面特性微差异（：糖基化）指示病毒靶病毒分配形式完全实验室增殖相关病毒分配野生株然果病毒降低量重复果影响病毒分配生产参数适确定控制组份般公认含病毒组份分开符合效步骤标准（认效灭活病毒步骤）
（六）验证目确定生产工艺灭活病毒力获生产全程中估计灭活病毒总量般降低总量步降低病毒量总病毒验证局限性分步骤中病毒降低量≤1 log应计算总量中
五灭活病毒方法验证
种情况需进行病毒灭活方法验证：
（）首次生产者需生产工艺中特定灭活病毒方法进行验证
（二）采新工艺原生产工艺进行重改革时需生产工艺进行清病毒
力验证特定灭活病毒方法进行灭活病毒效果验证
（三）工艺改变属重工艺改革时需特定灭活病毒方法进行验证
（四）灭活中间品组成成分pH值发生改变时需特定灭活病毒方法
进行验证
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