第八章 杂交芯片技术
学目标
掌握：1．核酸分子杂交基概念
2．探针种类标记方法
3．常见核酸分子杂交技术原理
4．DNA芯片设计制备
熟悉：1．核酸分子杂交信号检测方法
解：1．核酸杂交DNA芯片技术应
第节 杂交基概念
杂交（hybridization）指源单链核酸根碱基互补配原适条件形成杂化双链程利核酸杂交检测目核酸方法称核酸分子杂交技术该技术定性定量检测靶DNA靶RNA力工具区分杂交体单链核酸分子通常需参杂交反应寡核苷酸分子进行标记段标记寡核苷酸称探针探针靶核酸序列互补适条件通碱基互补配方式靶核酸序列杂交反应结束根标记信号判断靶核酸序列位置含量
核酸分子杂交
核酸杂交基核酸变性复性特性建立知道变性DNA两条互补链适条件恢复天然双螺旋构象两条链间存碱基配关系果种类单链DNA分子RNA分子放定条件溶液中两条单链核酸分子间存定程度碱基互补配形成杂化双链（heteroduplex）源单链核酸形成双链程称核酸分子杂交种杂化双链DNADNA单链间形成RNARNA单链分子间形成甚DNA单链分子RNA单链分子间形成见图81
图81核酸杂交原理示意图
核酸杂交分类划分方式根杂交核酸分子种类分DNADNADNARNARNARNA根杂交探针分放射性核素杂交非放射性核素杂交根杂交介质分液相杂交固相杂交原位杂交
核酸分子杂交技术源核酸片段碱基互补配规律形成异源双链DNARNA进行定性定量分析项技术利核酸杂交技术研究物种体DNA间亲缘关系发现靶基缺失突变通标记信号强度测定某种遗传信息量少证明某种疾病(肿瘤)否某种基(病毒基)关等核酸分子杂交技术基程包括核酸分子探针选择探针制备标记核酸分子杂交杂交结果分析四程制备标记合适探针核酸分子杂交技术成功关键
二探针类型
探针指段带检测标记目DNA目RNA特异互补已知核苷酸序列根探针制备方法核酸性质探针分基组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针四类
1．寡核苷酸探针 公司设计合成长度般18～30bp 优点：①制备方便根需行设计避免天然核酸探针存高度重复序列②数寡核苷酸探针长度15～30bp中碱基配会显著影响熔解温度特适基点突变杂交分析③活度高适数杂交DNA序列测定Southern杂交Northern杂交原位杂交等缺点探针短探针特异性差靶序列形成杂交体稳定性差杂交漂洗温度盐浓度等条件求高操作难度背景噪音
2．基组DNA探针 利机械剪切限制性切酶消化基组DNA制备成定DNA片段片段插入适载体中转化宿细胞构建成基组DNA文库进文库中筛选出含目基阳性克隆扩增提取DNA酶切电泳分离足够量基片段适标记作探针采PCR方法扩增基组DNA片段制备基组DNA探针选择类探针时特注意真核基组中存高度重复序列基编码序列（外显子）作探针避免含子非编码序否探针中高度重复序列存引起非特异性杂交出现假阳性优点：制备方法简单易降解标记方法成熟
3．cDNA探针 mRNA转录逆转录酶作mRNA 模板合成cDNA第链进合成第二链合成cDNA插入适载体中构建cDNA文库然筛选适阳性克隆进步扩增酶切纯化该cDNA片段见图82示采PCR方法扩增该方法优点双链探针长度较长靶序列形成杂交体稳定性特异性寡核苷酸探针高杂交信号强缺点双链必须先变性杂交杂交程中存复性现象
图82 cDNA探针制备
4．RNA探针 分离RNA者利噬菌体赖DNARNA聚合酶双链DNA模板体外转录成优点：①RNARNARNADNA杂交体系稳定性高②单链存变性复性③RNA中存高度重复序列非特异性杂交少④杂交RNase未杂交游离探针消化掉底降低缺点：RNA容易降解标记方法相复杂
三探针标记
确定探针否相应核酸分子杂交必探针加标记便结合部位获识信号理想探针标记物应具备特性：①高度灵敏性②影响碱基配特异性③影响探针分子理化性质④酶促反应活性影响⑤检测方法具高度灵敏性高度特异性
核酸探针常标记物两类类放射性标记物放射性位素3H32P35S125I等32P应普遍 优点：灵敏度高检测1018g物质高特异性假阳性结果较少缺点：易造成放射性污染存位素半衰期限制第二类非放射性位素标记物高辛素辣根氧化酶碱性磷酸酶等优点环境污染较长时间贮存缺点灵敏度高
探针标记全程标记探针3′端5′端进行标记探针体外标记法分化学法酶法：①化学法利标记物分子活性基探针分子基（磷酸基）发生化学反应标记物直接结合探针分子标记物标记方法常125I标记光敏生物素（photobiotin）标记②酶法酶促标记法预先放射性位素非放射性标记物连接NTPdNTP然利酶促反应标记核苷酸分子掺探针分子中核苷酸分子标记基交换探针分子标记物标记方法常125I标记光敏生物素（photobiotin）标记面介绍种常探针标记方法
1．缺口移法 缺口移法（nick translationNT）目前实验室常种脱氧核糖核酸探针标记法利肠杆菌DNA聚合酶I 种酶促活性标记dNTPs掺入新合成DNA链中探针标记带缺口线状超螺旋环状双链DNA均作切口移法模板首先利DNase IDNA双链造成单链切口然利肠杆菌DNA聚合酶I5¢®3¢核酸外切酶活性切口处旧链5¢末端逐步切DNA聚合酶I5¢®3¢聚合酶催化dNTP底物碱基互补原切口3¢末端OH合成新DNA链时标记核苷酸掺入新DNA链中见图83该方法优点够较控制探针长度探针放射活性强
图83 缺口移法示意图
2．机引物标记法 机引物标记法（random primingRP）原理机引物种单链DNA模板结合作合成新链引物DNA聚合酶催化5¢®3¢方合成新DNA链核苷酸序列模板DNA完全互补单链DNA模板样合成条新完全互补DNA链合成时带放射性位素标记核苷酸掺入新合成DNA分子中见图84机引物法具优点：进行双链DNA单链DNARNA探针标记操作简单方便避免DNaseI处理浓度掌握带系列问题标记活性高直接低熔点琼脂糖溶液中进行标记缺点探针产量缺口移法低
图84 机引物标记法示意图
3．末端标记法 末端标记法核酸片段5¢末端3¢末端进行部分标记分3¢末端标记5¢末端标记① 3′末端标记：探针3′末端末端转移酶掺入单标记[α32P]dNTP 3′末端标记法包括限制酶切聚合酶合成两程3′标记两种方式：肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法T4 DNA聚合酶标记法见图85② 5′末端标记 ：先碱性磷酸酶（AP）掉dsDNA 5′磷酸T4核苷酸激酶催化 ATP分子γ磷酸基团转移DNARNA分子5′－OH基团采γ32PATP底物DNA样品5′端标记核酸样品5′端必需磷酸见图86
图85 3′末端标记法
图86 5′末端标记法
4．PCR标记法 PCR反应体系中利标记核苷酸作反应底物标记DNA片段模板PCR扩增结束标记核苷酸掺入新合成DNA分子中制备成特异探针分子前必须进行探针变性处理该方法获探针分子产量高
四杂交信号检测
杂交信号检测方法选择取决探针标记物性质常核酸探针标记物检测方法见表81
表81常核酸探针标记检测
标记物性质
标记分子
标记方法
检测方法
放射性物质标记
[α32P ]dNTP
NTPCRRP
放射显影
[γ32P ]dNTP
末端标记法
放射显影
35S
NT
放射显影
非放射性物质标记
生物素
Bio11dUTP
NTPCRRP
酶标亲素酶标
光敏生物素
600W见光
抗生物素抗体显色
生物素化补骨脂素
365紫外线
抗生物素抗体显色
酶
氧化物酶
化学合成法直接法
直接底物显色酶
碱性磷酸酶
化学合成法直接法
直接底物显色酶
荧光素
罗丹明FITC
合成法
荧光显微镜观察酶
半抗原
高辛
RPNT
酶标抗体+底物显色
1．放射性核素标记探针检测 放射性核素标记探针杂交常放射显影进行检测该方法基放射性核素释放量片纸感化原理32P标记杂交常检测方法放射显影该方法基原理位素断衰变程中释放出β粒子粒子撞击X光片感光层形成潜影显影成
2．非放射性核素标记探针检测 非放射性核素标记探针杂交选色化学发光法检测基原理通偶联反应显色反应两步实现首先通抗原抗体免疫反应系统显色体系偶联高辛系类固醇半抗原化合物高辛标记探针杂交信号通酶联免疫法抗高辛抗体碱性磷酸酶复合物结合然进行酶促显色反应三类显色反应结果观察① 酶促显色法常酶碱性磷酸酶（alkaline phosphataseAKP）辣根氧化物酶(horseradish peroxidaseHRP)图87示② 荧光法荧光素标记探针杂交通荧光显微镜观察者免疫组织化学法检测原位杂交检测常FITC③ 化学发光法化学反应中释放量光形式发射出某底物碱性磷酸酶水解时会发光形成检测信号发射光线强度反映酶活性体现杂交分析量尼龙膜硝酸纤维素薄膜均化学发光检测
图87 酶促显色法原理
第二节 常见核酸分子杂交技术
核酸分子杂交反应溶液进行（液相杂交）固相支持物硝酸纤维素尼龙膜进行（固相杂交）固相杂交根诊断目杂交方式分Southern杂交（Southern blot）Northern杂交（Northern blot）斑点杂交（dot blot）原位杂交（in situ hybridizationISH）等位基特异性寡核苷酸杂交（allele specific oligonucleotideASO）菌落杂交反点杂交等谓印迹杂交指凝胶中分离生物分子转移者直接放固定化介质然液相中核酸分子探针进行杂交加监测分析程核酸分子杂交技术途见表82
表82 核酸分子类型途
杂交类型
检测目范围
Southern印迹杂交
检测凝胶电泳分离转移膜DNA分子
Northern印迹杂交
检测凝胶电泳分离转移膜RNA分子
菌落杂交
检测固定膜裂解细菌体释放DNA分子
斑点杂交
检测固定膜DNARNA分子
原位杂交
检测细胞涂片组织切片中DNARNA分子
原位杂交
原位杂交已标记核酸探针组织切片细胞中测核酸碱基互补配原进行特异性杂交然应组织化学免疫组织化学法显微镜进行细胞定位定性定量分析方法该技术基原理根检测靶DNA序列设计互补探针变性单链靶DNA已标记探针分子低温复性形成靶DNA探针杂交体图88示该技术反应程中保持细胞形态甚单染色体形态完整通常正常异常染色体基定位组织细胞基表达位点确定转录水分析病毒病原体感染检测等该技术遗传学病理学基诊断学等领域广泛应
图88 原位杂交示意图
目前应原位杂交荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridizationFISH）探针应荧光素直接间接标记荧光素（异硫氰酸荧光素）直接标记探针杂交荧光扫描聚焦显微镜直接观察该方法操作简单灵敏度差生物素高辛间接标记探针杂交结果检具直观快速高灵敏度特点广泛应FISH技术广泛应较基组杂交基图谱绘制生殖医学病原微生物检测等
知识拓展：
原位杂交技术发明
1969年PardueJohn等两研究组发明原位杂交技术（ISH）采放射性标记DNA28SrRNA 1988年Giovannoni等首次ISH引入细菌学研究放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物 1989年Delong首次荧光标记寡核苷酸探针检测单微生物细胞利位素标记核酸探针确定基细胞组织定位创造原位杂交技术着分子生物学发展典原位杂交技术出现更简洁快速新技术
二斑点杂交
斑点杂交变性DNARNA测样品直接点样硝酸纤维素薄膜固相载体然加入量标记核酸探针进行杂交该技术优点张膜时进行样品检测样品量少方法简便快速灵敏缺点鉴定靶核酸分子特异性低斑点杂交技术基组中特定基表达产物定性定量分析
三Southern杂交
Southern杂交电泳分离DNA片段转移定固相支持物通标记探针进行杂交目DNA进行检测分析程
Southern杂交基操作程：① 分离提取DNA样品限制性切酶酶切②酶切样品DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离电泳分离DNA样品凝胶放入变性液中DNA变性③ 取出含变性DNA凝胶硝酸纤维素薄膜固相支持物放通电转移毛细虹吸作利真空抽滤作等方法等凝胶DNA转移支持物高温烘烤DNA牢固吸附固相支持物转移程中保持DNA条带间位置变④ 加入核酸探针固相支持物DNA片段杂交⑤ 洗固相支持物未杂交探针⑥ 检测杂交信号图89示
图89 Southren 杂交
Southern杂交技术检测基组DNA基组DNA中特定基定性定量分析外源基转入源基突变等
四Northern杂交
Northern杂交种RNA分子电泳凝胶中转移定固相支持物通标记探针进行杂交然RNA加检测分析方法
Northern杂交基程Southern杂交相似转移核酸分子RNARNA分子较转移前需限制性切酶消化电泳分离前需甲基氢氧化银乙二醛甲醛RNA变性利硝酸纤维素薄膜结合Northern杂交Southern杂交较图810示
图810 Southern杂交Northern杂交较
Northern杂交目前应检测某组织细胞中已知特异mRNA表达水较组织细胞中基表达情况Northern杂交检测mRNA表达水灵敏度较PCR差特异性高假阳性率低失种检测mRNA表达水方法
知识拓展：
Southern杂交Northern杂交名称
Southern杂交英国牛津学著名生物化学家埃德温•迈勒•萨瑟恩(Edwin Mellor Southern)1975年爱丁堡学职时发明该技术EMSouthern首创 项技术命名Southern印迹杂交该技术基组DNA特定序列进行定位方法Northern杂交斯坦福学George Stark教授1975年发明 杂交原理Edwin Mellor Southern教授发明Southern杂交原理相似实验程相似取类似名字Northern杂交 原理变性条件检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳 继Southern 杂交相原理进行转膜探针进行杂交检测
五等位基特异性寡核苷酸探针杂交
根已知基突变位点核苷酸序列工合成两种寡核苷酸探针：种相应突变基序列设计寡核苷酸探针（M）种相应正常基碱基序列设计寡核苷酸探针（N）两种探针分受检者DNA样品进行分子杂交会出现4种情况：① 受检者DNAM杂交N杂交说明受检者种基突变纯合子②受检者DNAM杂交N杂交说明受检者种基突变杂合子③受检者DNAM杂交N杂交说明受检者该种基突变④受检者DNAMN均杂交提示患者缺陷基种新型基突变
第三节 DNA芯片技术
DNA芯片技术20世纪末发展起项规模高通量应核酸杂交技术新核酸分析技术目前已应基表达分析基突变检测基诊断功基组较研究基组作图新基发现等诸研究领域
DNA芯片技术概述
基芯片（gene chip）称DNA芯片DNA阵列DNA芯片技术基原理核酸分子杂交指许特定DNA探针规律紧密排列固定单位面积固相支持物形成高密度DNA微阵列然测荧光标记样品进行特异性杂交通激光聚焦荧光检测系统芯片进行扫描配计算机系统探针荧光信号作出较分析迅速出目基定性定量分析结果基芯片分类分成种类根片基分机片基芯片（半导体硅片玻璃片）机合成物片基芯片（硝酸纤维素薄膜尼龙膜）根应分表达谱芯片诊断芯片检测芯片等根结构分寡核苷酸芯片cDNA芯片基组芯片等
二DNA芯片设计制备
DNA芯片设计原保证DNA探针特异性准确性设计容包括DNA探针特异性设计芯片DNA点阵定位DNA探针特异性通基文库DNA测序结果获双链DNA芯片DNA探针常PCR扩增产物首先必须保证获产物序列准确性PCR扩增产物序列准确性通设计特异引物保证引物Tm值致扩增片段致性等实现芯片DNA点阵定位设计双重三重重复点阵外区域需增加阴性阳性校正重复点阵保证结果性阴性含DNA空点作芯片背景控制阳性定量加入相应标记DNA获取信号作外标准衡量校正芯片区域杂交差异
DNA芯片基表达转录水靶DNA片段中否存态性点突变检测根芯片应目探针序列设计需具针性表达型芯片探针设计需设计出针基中特定区域套寡核苷酸探针cDNA探针序列源已知基cDNA序列单核苷酸态性检测芯片探针设计般采长移位设计法靶序列头尾取16～25bp靶序列完全互补寡核苷酸形成探针组合设计组相应靶序列完全互补寡核苷酸探针分样品进行杂交较杂交信号特定突变位点探针设计测定变化点应该出现设计探针中心便突变位置发生变化检测
芯片探针载体选择影响芯片技术关键常固相载体材料玻片硅片硝酸纤维素薄膜尼龙膜聚丙烯膜等材料前必须进行活化增加载体探针结合力活化方式载体表面涂布聚赖氨酸包氨基硅烷耦联试剂
常DNA芯片制备方法直接点样法原位合成法① 直接点样法：指预先合成寡核苷酸cDNA基组DNA通高速点样机直接点芯片理化方法固定② 原位合成法：指利4种核苷酸直接芯片载体合成需DNA探针适制备寡核苷酸芯片制备规模DNA探针芯片原位合成方法包括：光导原位合成法原位喷印合成法分子印章合成法光导原位合成法半导体工业光蚀刻技术DNA合成技术结合起利光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体活性羟基通设计特定光刻掩膜断更换曝光区域基片受光保护羟基脱保护二活化加入核苷酸底物直接片基合成寡核苷酸探针原位喷印合成法利微喷头DNA合成试剂定序次逐层喷印基片表面位置分子印章合成法指利分子印章（硅橡胶模板）根预先设计探针矩阵次准确压印片基高密度基芯片图811示进行芯片制备时需根芯片设计芯片途选择制备方法便提高检测结果准确性
图811 原位合成芯片示意图
三DNA芯片应基操作
DNA芯片应基操作包括：样品制备杂交反应杂交信号检测结果分析图812示
图 812 DNA芯片操作流程
（）样品制备
DNA芯片检测样品制备包括核酸纯化扩增标记核酸样品复杂生物分子提取物常常含杂质需进行纯化纯化DNA样品作PCR扩增模板进行PCR扩增然PCR扩增量产物进行标记果初始样品总RNAmRNA时首先进行RNA纯化然进行RTPCR扩增扩增产物进行标记常标记方法荧光标记法般荧光标记引物荧光标记dNTPPCR扩增时荧光加入探针中标记样品需进行次纯化否会造成荧光背景偏高影响结果分析荧光标记物：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynateFITC）罗丹明（lissamine rhodamine B200RB200）六氯6甲基荧光素（6hexachlorofluoresceinHEX）四甲基罗丹明（tetramethylrhodamineTMR）羧基荧光素（carboxyfluoresceinFAM）等
（二）杂交反应
DNA芯片杂交反应传统核酸杂交方法相似进行杂交反应前必须考虑杂交温度杂交液组分杂交时间标记样品DNA浓度探针DNA长度芯片途等素提高杂交反应质量直接关系检测结果准确性
（三）杂交信号检测结果分析
杂交信号检测方法根标记物进行选择常荧光法荧光信号检测仪器激光聚焦芯片扫描仪电荷偶联装置（charge coupled deviceCCD）芯片扫描仪DNA芯片检测原理基双色荧光探针杂交该系统两源样品DNA分子荧光分子（正常红色肿瘤绿色）进行标记标记DNA分子等量混合基芯片进行杂交两组激发光检测获两样品芯片全部杂交信号呈现绿色荧光位点代表该基肿瘤组织表达呈现红色荧光信号位点代表该基正常组织表达呈现两种荧光互补色—黄色位点表明该基两种组织中均表达见图812扫描芯片图谱需专门软件进行分析处理
四DNA芯片技术应
DNA芯片技术具动化运行样品检测高通量灵敏度高检测结果准确度高等独优势已成医学分子生物学研究领域项重技术具体应体现领域：① 生命科学研究基表达分析基型基突变基态性分析基组较等② 床疾病诊断遗传性疾病感染性疾病肿瘤等诊断指导药治疗方案确定预防医学等③ 药物研发药物筛选等着研究深入DNA芯片技术会更广泛应
（马晓磊 张阳）
题
选择题
A型选择题
1．列作核酸探针分子包括：
A．基组DNA探针 B．cDNA探针 C．RNA探针
D．寡核苷酸探针 E．均
2．5′末端DNA探针标记酶：
A．T4聚核苷酸激酶 B．末端转移酶 C．AKP D．DNA polⅡ E．DNA pol
3．Southern杂交通常指：
A．DNARNA杂交 B．DNADNA杂交 C．RNARNA杂交
D．蛋白质蛋白质杂交 E．DNA蛋白质杂交
4．检测靶序列RNA技术：
A．Southern杂交 B．Western杂交 C．Northern杂交
D．Eastern杂交 E．等位基特异性寡核苷酸杂交
5．RNADNA变性直接点样硝酸纤维素膜基组中特定基表达定性定量研究称：
A．原位杂交 B．斑点杂交 C．Southern杂交
D．Northern杂交 E．Western杂交
6．标记参杂交反应核酸分子称：
A．引物 B．探针 C．dsDNA D．ssDNA E．寡核苷酸分子
7．基芯片技术质：
A．核酸分子杂交技术 B．蛋白质分子杂交技术 C．聚合酶链反应技术
D．基重组技术 E．DNA酶切技术
8．等位基特异寡糖苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时突变探针正常探针接合该样：
A．正常 B．杂合体患者 C．纯合体患 D．携带者 E．确定
9．核酸保持细胞组织切片中适方法处理细胞组织标记核酸探针细胞组织中核酸进行杂交称：
A．原位杂交 B．RNA杂交 C．斑点杂交 D．菌落杂交 E．DNA杂交
10．固定膜DNA片段探针进行杂交前必须膜DNA结合位点全部封闭称：
A．杂交 B．预杂交 C．杂交前处理 D．原位杂交 E．封闭
11．荧光原位杂交：
A．快速确定否存目基 B．检测目标RNA C．基定位分析
D．阳性菌落筛选 E．蛋白水检测
X型选择题
12．标记核酸探针常核素：
A．32P B．3H C．35S D．125I E．14C
13．列探针全程标记方法：
A．缺口移标记法 B．机引物标记法 C．5′末端标记法
D．3′末端标记法 E．PCR标记法
14．影响核酸杂交素：
A．靶DNA分子浓度 B．靶DNA分子长度 C．杂交液组分
D．杂交时间 E．杂交温度
15．基芯片支持介质：
A．硝酸纤维素薄膜 B．玻璃片 C．尼龙膜
D．琼脂糖凝胶 E．聚丙烯酰胺凝胶
16．列作核酸探针：
A．寡核苷酸 B．单链cDNA C．DNA D．RNA E． mRNA
17．关核酸探针描述列正确：
A．DNA B．RNA C．放射性标记
D．非放射性标记 E．必须单链核酸
二思考题
1．简述探针类型制备方法
2．简述常见DNA杂交类型原理
3．简述DNA芯片制备方法
4．简述DNA芯片技术操作流程
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学目标
掌握：1．核酸分子杂交基概念
2．探针种类标记方法
3．常见核酸分子杂交技术原理
4．DNA芯片设计制备
熟悉：1．核酸分子杂交信号检测方法
解：1．核酸杂交DNA芯片技术应
第节 杂交基概念
杂交（hybridization）指源单链核酸根碱基互补配原适条件形成杂化双链程利核酸杂交检测目核酸方法称核酸分子杂交技术该技术定性定量检测靶DNA靶RNA力工具区分杂交体单链核酸分子通常需参杂交反应寡核苷酸分子进行标记段标记寡核苷酸称探针探针靶核酸序列互补适条件通碱基互补配方式靶核酸序列杂交反应结束根标记信号判断靶核酸序列位置含量
核酸分子杂交
核酸杂交基核酸变性复性特性建立知道变性DNA两条互补链适条件恢复天然双螺旋构象两条链间存碱基配关系果种类单链DNA分子RNA分子放定条件溶液中两条单链核酸分子间存定程度碱基互补配形成杂化双链（heteroduplex）源单链核酸形成双链程称核酸分子杂交种杂化双链DNADNA单链间形成RNARNA单链分子间形成甚DNA单链分子RNA单链分子间形成见图81
图81核酸杂交原理示意图
核酸杂交分类划分方式根杂交核酸分子种类分DNADNADNARNARNARNA根杂交探针分放射性核素杂交非放射性核素杂交根杂交介质分液相杂交固相杂交原位杂交
核酸分子杂交技术源核酸片段碱基互补配规律形成异源双链DNARNA进行定性定量分析项技术利核酸杂交技术研究物种体DNA间亲缘关系发现靶基缺失突变通标记信号强度测定某种遗传信息量少证明某种疾病(肿瘤)否某种基(病毒基)关等核酸分子杂交技术基程包括核酸分子探针选择探针制备标记核酸分子杂交杂交结果分析四程制备标记合适探针核酸分子杂交技术成功关键
二探针类型
探针指段带检测标记目DNA目RNA特异互补已知核苷酸序列根探针制备方法核酸性质探针分基组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针四类
1．寡核苷酸探针 公司设计合成长度般18～30bp 优点：①制备方便根需行设计避免天然核酸探针存高度重复序列②数寡核苷酸探针长度15～30bp中碱基配会显著影响熔解温度特适基点突变杂交分析③活度高适数杂交DNA序列测定Southern杂交Northern杂交原位杂交等缺点探针短探针特异性差靶序列形成杂交体稳定性差杂交漂洗温度盐浓度等条件求高操作难度背景噪音
2．基组DNA探针 利机械剪切限制性切酶消化基组DNA制备成定DNA片段片段插入适载体中转化宿细胞构建成基组DNA文库进文库中筛选出含目基阳性克隆扩增提取DNA酶切电泳分离足够量基片段适标记作探针采PCR方法扩增基组DNA片段制备基组DNA探针选择类探针时特注意真核基组中存高度重复序列基编码序列（外显子）作探针避免含子非编码序否探针中高度重复序列存引起非特异性杂交出现假阳性优点：制备方法简单易降解标记方法成熟
3．cDNA探针 mRNA转录逆转录酶作mRNA 模板合成cDNA第链进合成第二链合成cDNA插入适载体中构建cDNA文库然筛选适阳性克隆进步扩增酶切纯化该cDNA片段见图82示采PCR方法扩增该方法优点双链探针长度较长靶序列形成杂交体稳定性特异性寡核苷酸探针高杂交信号强缺点双链必须先变性杂交杂交程中存复性现象
图82 cDNA探针制备
4．RNA探针 分离RNA者利噬菌体赖DNARNA聚合酶双链DNA模板体外转录成优点：①RNARNARNADNA杂交体系稳定性高②单链存变性复性③RNA中存高度重复序列非特异性杂交少④杂交RNase未杂交游离探针消化掉底降低缺点：RNA容易降解标记方法相复杂
三探针标记
确定探针否相应核酸分子杂交必探针加标记便结合部位获识信号理想探针标记物应具备特性：①高度灵敏性②影响碱基配特异性③影响探针分子理化性质④酶促反应活性影响⑤检测方法具高度灵敏性高度特异性
核酸探针常标记物两类类放射性标记物放射性位素3H32P35S125I等32P应普遍 优点：灵敏度高检测1018g物质高特异性假阳性结果较少缺点：易造成放射性污染存位素半衰期限制第二类非放射性位素标记物高辛素辣根氧化酶碱性磷酸酶等优点环境污染较长时间贮存缺点灵敏度高
探针标记全程标记探针3′端5′端进行标记探针体外标记法分化学法酶法：①化学法利标记物分子活性基探针分子基（磷酸基）发生化学反应标记物直接结合探针分子标记物标记方法常125I标记光敏生物素（photobiotin）标记②酶法酶促标记法预先放射性位素非放射性标记物连接NTPdNTP然利酶促反应标记核苷酸分子掺探针分子中核苷酸分子标记基交换探针分子标记物标记方法常125I标记光敏生物素（photobiotin）标记面介绍种常探针标记方法
1．缺口移法 缺口移法（nick translationNT）目前实验室常种脱氧核糖核酸探针标记法利肠杆菌DNA聚合酶I 种酶促活性标记dNTPs掺入新合成DNA链中探针标记带缺口线状超螺旋环状双链DNA均作切口移法模板首先利DNase IDNA双链造成单链切口然利肠杆菌DNA聚合酶I5¢®3¢核酸外切酶活性切口处旧链5¢末端逐步切DNA聚合酶I5¢®3¢聚合酶催化dNTP底物碱基互补原切口3¢末端OH合成新DNA链时标记核苷酸掺入新DNA链中见图83该方法优点够较控制探针长度探针放射活性强
图83 缺口移法示意图
2．机引物标记法 机引物标记法（random primingRP）原理机引物种单链DNA模板结合作合成新链引物DNA聚合酶催化5¢®3¢方合成新DNA链核苷酸序列模板DNA完全互补单链DNA模板样合成条新完全互补DNA链合成时带放射性位素标记核苷酸掺入新合成DNA分子中见图84机引物法具优点：进行双链DNA单链DNARNA探针标记操作简单方便避免DNaseI处理浓度掌握带系列问题标记活性高直接低熔点琼脂糖溶液中进行标记缺点探针产量缺口移法低
图84 机引物标记法示意图
3．末端标记法 末端标记法核酸片段5¢末端3¢末端进行部分标记分3¢末端标记5¢末端标记① 3′末端标记：探针3′末端末端转移酶掺入单标记[α32P]dNTP 3′末端标记法包括限制酶切聚合酶合成两程3′标记两种方式：肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法T4 DNA聚合酶标记法见图85② 5′末端标记 ：先碱性磷酸酶（AP）掉dsDNA 5′磷酸T4核苷酸激酶催化 ATP分子γ磷酸基团转移DNARNA分子5′－OH基团采γ32PATP底物DNA样品5′端标记核酸样品5′端必需磷酸见图86
图85 3′末端标记法
图86 5′末端标记法
4．PCR标记法 PCR反应体系中利标记核苷酸作反应底物标记DNA片段模板PCR扩增结束标记核苷酸掺入新合成DNA分子中制备成特异探针分子前必须进行探针变性处理该方法获探针分子产量高
四杂交信号检测
杂交信号检测方法选择取决探针标记物性质常核酸探针标记物检测方法见表81
表81常核酸探针标记检测
标记物性质
标记分子
标记方法
检测方法
放射性物质标记
[α32P ]dNTP
NTPCRRP
放射显影
[γ32P ]dNTP
末端标记法
放射显影
35S
NT
放射显影
非放射性物质标记
生物素
Bio11dUTP
NTPCRRP
酶标亲素酶标
光敏生物素
600W见光
抗生物素抗体显色
生物素化补骨脂素
365紫外线
抗生物素抗体显色
酶
氧化物酶
化学合成法直接法
直接底物显色酶
碱性磷酸酶
化学合成法直接法
直接底物显色酶
荧光素
罗丹明FITC
合成法
荧光显微镜观察酶
半抗原
高辛
RPNT
酶标抗体+底物显色
1．放射性核素标记探针检测 放射性核素标记探针杂交常放射显影进行检测该方法基放射性核素释放量片纸感化原理32P标记杂交常检测方法放射显影该方法基原理位素断衰变程中释放出β粒子粒子撞击X光片感光层形成潜影显影成
2．非放射性核素标记探针检测 非放射性核素标记探针杂交选色化学发光法检测基原理通偶联反应显色反应两步实现首先通抗原抗体免疫反应系统显色体系偶联高辛系类固醇半抗原化合物高辛标记探针杂交信号通酶联免疫法抗高辛抗体碱性磷酸酶复合物结合然进行酶促显色反应三类显色反应结果观察① 酶促显色法常酶碱性磷酸酶（alkaline phosphataseAKP）辣根氧化物酶(horseradish peroxidaseHRP)图87示② 荧光法荧光素标记探针杂交通荧光显微镜观察者免疫组织化学法检测原位杂交检测常FITC③ 化学发光法化学反应中释放量光形式发射出某底物碱性磷酸酶水解时会发光形成检测信号发射光线强度反映酶活性体现杂交分析量尼龙膜硝酸纤维素薄膜均化学发光检测
图87 酶促显色法原理
第二节 常见核酸分子杂交技术
核酸分子杂交反应溶液进行（液相杂交）固相支持物硝酸纤维素尼龙膜进行（固相杂交）固相杂交根诊断目杂交方式分Southern杂交（Southern blot）Northern杂交（Northern blot）斑点杂交（dot blot）原位杂交（in situ hybridizationISH）等位基特异性寡核苷酸杂交（allele specific oligonucleotideASO）菌落杂交反点杂交等谓印迹杂交指凝胶中分离生物分子转移者直接放固定化介质然液相中核酸分子探针进行杂交加监测分析程核酸分子杂交技术途见表82
表82 核酸分子类型途
杂交类型
检测目范围
Southern印迹杂交
检测凝胶电泳分离转移膜DNA分子
Northern印迹杂交
检测凝胶电泳分离转移膜RNA分子
菌落杂交
检测固定膜裂解细菌体释放DNA分子
斑点杂交
检测固定膜DNARNA分子
原位杂交
检测细胞涂片组织切片中DNARNA分子
原位杂交
原位杂交已标记核酸探针组织切片细胞中测核酸碱基互补配原进行特异性杂交然应组织化学免疫组织化学法显微镜进行细胞定位定性定量分析方法该技术基原理根检测靶DNA序列设计互补探针变性单链靶DNA已标记探针分子低温复性形成靶DNA探针杂交体图88示该技术反应程中保持细胞形态甚单染色体形态完整通常正常异常染色体基定位组织细胞基表达位点确定转录水分析病毒病原体感染检测等该技术遗传学病理学基诊断学等领域广泛应
图88 原位杂交示意图
目前应原位杂交荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridizationFISH）探针应荧光素直接间接标记荧光素（异硫氰酸荧光素）直接标记探针杂交荧光扫描聚焦显微镜直接观察该方法操作简单灵敏度差生物素高辛间接标记探针杂交结果检具直观快速高灵敏度特点广泛应FISH技术广泛应较基组杂交基图谱绘制生殖医学病原微生物检测等
知识拓展：
原位杂交技术发明
1969年PardueJohn等两研究组发明原位杂交技术（ISH）采放射性标记DNA28SrRNA 1988年Giovannoni等首次ISH引入细菌学研究放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物 1989年Delong首次荧光标记寡核苷酸探针检测单微生物细胞利位素标记核酸探针确定基细胞组织定位创造原位杂交技术着分子生物学发展典原位杂交技术出现更简洁快速新技术
二斑点杂交
斑点杂交变性DNARNA测样品直接点样硝酸纤维素薄膜固相载体然加入量标记核酸探针进行杂交该技术优点张膜时进行样品检测样品量少方法简便快速灵敏缺点鉴定靶核酸分子特异性低斑点杂交技术基组中特定基表达产物定性定量分析
三Southern杂交
Southern杂交电泳分离DNA片段转移定固相支持物通标记探针进行杂交目DNA进行检测分析程
Southern杂交基操作程：① 分离提取DNA样品限制性切酶酶切②酶切样品DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离电泳分离DNA样品凝胶放入变性液中DNA变性③ 取出含变性DNA凝胶硝酸纤维素薄膜固相支持物放通电转移毛细虹吸作利真空抽滤作等方法等凝胶DNA转移支持物高温烘烤DNA牢固吸附固相支持物转移程中保持DNA条带间位置变④ 加入核酸探针固相支持物DNA片段杂交⑤ 洗固相支持物未杂交探针⑥ 检测杂交信号图89示
图89 Southren 杂交
Southern杂交技术检测基组DNA基组DNA中特定基定性定量分析外源基转入源基突变等
四Northern杂交
Northern杂交种RNA分子电泳凝胶中转移定固相支持物通标记探针进行杂交然RNA加检测分析方法
Northern杂交基程Southern杂交相似转移核酸分子RNARNA分子较转移前需限制性切酶消化电泳分离前需甲基氢氧化银乙二醛甲醛RNA变性利硝酸纤维素薄膜结合Northern杂交Southern杂交较图810示
图810 Southern杂交Northern杂交较
Northern杂交目前应检测某组织细胞中已知特异mRNA表达水较组织细胞中基表达情况Northern杂交检测mRNA表达水灵敏度较PCR差特异性高假阳性率低失种检测mRNA表达水方法
知识拓展：
Southern杂交Northern杂交名称
Southern杂交英国牛津学著名生物化学家埃德温•迈勒•萨瑟恩(Edwin Mellor Southern)1975年爱丁堡学职时发明该技术EMSouthern首创 项技术命名Southern印迹杂交该技术基组DNA特定序列进行定位方法Northern杂交斯坦福学George Stark教授1975年发明 杂交原理Edwin Mellor Southern教授发明Southern杂交原理相似实验程相似取类似名字Northern杂交 原理变性条件检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳 继Southern 杂交相原理进行转膜探针进行杂交检测
五等位基特异性寡核苷酸探针杂交
根已知基突变位点核苷酸序列工合成两种寡核苷酸探针：种相应突变基序列设计寡核苷酸探针（M）种相应正常基碱基序列设计寡核苷酸探针（N）两种探针分受检者DNA样品进行分子杂交会出现4种情况：① 受检者DNAM杂交N杂交说明受检者种基突变纯合子②受检者DNAM杂交N杂交说明受检者种基突变杂合子③受检者DNAM杂交N杂交说明受检者该种基突变④受检者DNAMN均杂交提示患者缺陷基种新型基突变
第三节 DNA芯片技术
DNA芯片技术20世纪末发展起项规模高通量应核酸杂交技术新核酸分析技术目前已应基表达分析基突变检测基诊断功基组较研究基组作图新基发现等诸研究领域
DNA芯片技术概述
基芯片（gene chip）称DNA芯片DNA阵列DNA芯片技术基原理核酸分子杂交指许特定DNA探针规律紧密排列固定单位面积固相支持物形成高密度DNA微阵列然测荧光标记样品进行特异性杂交通激光聚焦荧光检测系统芯片进行扫描配计算机系统探针荧光信号作出较分析迅速出目基定性定量分析结果基芯片分类分成种类根片基分机片基芯片（半导体硅片玻璃片）机合成物片基芯片（硝酸纤维素薄膜尼龙膜）根应分表达谱芯片诊断芯片检测芯片等根结构分寡核苷酸芯片cDNA芯片基组芯片等
二DNA芯片设计制备
DNA芯片设计原保证DNA探针特异性准确性设计容包括DNA探针特异性设计芯片DNA点阵定位DNA探针特异性通基文库DNA测序结果获双链DNA芯片DNA探针常PCR扩增产物首先必须保证获产物序列准确性PCR扩增产物序列准确性通设计特异引物保证引物Tm值致扩增片段致性等实现芯片DNA点阵定位设计双重三重重复点阵外区域需增加阴性阳性校正重复点阵保证结果性阴性含DNA空点作芯片背景控制阳性定量加入相应标记DNA获取信号作外标准衡量校正芯片区域杂交差异
DNA芯片基表达转录水靶DNA片段中否存态性点突变检测根芯片应目探针序列设计需具针性表达型芯片探针设计需设计出针基中特定区域套寡核苷酸探针cDNA探针序列源已知基cDNA序列单核苷酸态性检测芯片探针设计般采长移位设计法靶序列头尾取16～25bp靶序列完全互补寡核苷酸形成探针组合设计组相应靶序列完全互补寡核苷酸探针分样品进行杂交较杂交信号特定突变位点探针设计测定变化点应该出现设计探针中心便突变位置发生变化检测
芯片探针载体选择影响芯片技术关键常固相载体材料玻片硅片硝酸纤维素薄膜尼龙膜聚丙烯膜等材料前必须进行活化增加载体探针结合力活化方式载体表面涂布聚赖氨酸包氨基硅烷耦联试剂
常DNA芯片制备方法直接点样法原位合成法① 直接点样法：指预先合成寡核苷酸cDNA基组DNA通高速点样机直接点芯片理化方法固定② 原位合成法：指利4种核苷酸直接芯片载体合成需DNA探针适制备寡核苷酸芯片制备规模DNA探针芯片原位合成方法包括：光导原位合成法原位喷印合成法分子印章合成法光导原位合成法半导体工业光蚀刻技术DNA合成技术结合起利光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体活性羟基通设计特定光刻掩膜断更换曝光区域基片受光保护羟基脱保护二活化加入核苷酸底物直接片基合成寡核苷酸探针原位喷印合成法利微喷头DNA合成试剂定序次逐层喷印基片表面位置分子印章合成法指利分子印章（硅橡胶模板）根预先设计探针矩阵次准确压印片基高密度基芯片图811示进行芯片制备时需根芯片设计芯片途选择制备方法便提高检测结果准确性
图811 原位合成芯片示意图
三DNA芯片应基操作
DNA芯片应基操作包括：样品制备杂交反应杂交信号检测结果分析图812示
图 812 DNA芯片操作流程
（）样品制备
DNA芯片检测样品制备包括核酸纯化扩增标记核酸样品复杂生物分子提取物常常含杂质需进行纯化纯化DNA样品作PCR扩增模板进行PCR扩增然PCR扩增量产物进行标记果初始样品总RNAmRNA时首先进行RNA纯化然进行RTPCR扩增扩增产物进行标记常标记方法荧光标记法般荧光标记引物荧光标记dNTPPCR扩增时荧光加入探针中标记样品需进行次纯化否会造成荧光背景偏高影响结果分析荧光标记物：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynateFITC）罗丹明（lissamine rhodamine B200RB200）六氯6甲基荧光素（6hexachlorofluoresceinHEX）四甲基罗丹明（tetramethylrhodamineTMR）羧基荧光素（carboxyfluoresceinFAM）等
（二）杂交反应
DNA芯片杂交反应传统核酸杂交方法相似进行杂交反应前必须考虑杂交温度杂交液组分杂交时间标记样品DNA浓度探针DNA长度芯片途等素提高杂交反应质量直接关系检测结果准确性
（三）杂交信号检测结果分析
杂交信号检测方法根标记物进行选择常荧光法荧光信号检测仪器激光聚焦芯片扫描仪电荷偶联装置（charge coupled deviceCCD）芯片扫描仪DNA芯片检测原理基双色荧光探针杂交该系统两源样品DNA分子荧光分子（正常红色肿瘤绿色）进行标记标记DNA分子等量混合基芯片进行杂交两组激发光检测获两样品芯片全部杂交信号呈现绿色荧光位点代表该基肿瘤组织表达呈现红色荧光信号位点代表该基正常组织表达呈现两种荧光互补色—黄色位点表明该基两种组织中均表达见图812扫描芯片图谱需专门软件进行分析处理
四DNA芯片技术应
DNA芯片技术具动化运行样品检测高通量灵敏度高检测结果准确度高等独优势已成医学分子生物学研究领域项重技术具体应体现领域：① 生命科学研究基表达分析基型基突变基态性分析基组较等② 床疾病诊断遗传性疾病感染性疾病肿瘤等诊断指导药治疗方案确定预防医学等③ 药物研发药物筛选等着研究深入DNA芯片技术会更广泛应
（马晓磊 张阳）
题
选择题
A型选择题
1．列作核酸探针分子包括：
A．基组DNA探针 B．cDNA探针 C．RNA探针
D．寡核苷酸探针 E．均
2．5′末端DNA探针标记酶：
A．T4聚核苷酸激酶 B．末端转移酶 C．AKP D．DNA polⅡ E．DNA pol
3．Southern杂交通常指：
A．DNARNA杂交 B．DNADNA杂交 C．RNARNA杂交
D．蛋白质蛋白质杂交 E．DNA蛋白质杂交
4．检测靶序列RNA技术：
A．Southern杂交 B．Western杂交 C．Northern杂交
D．Eastern杂交 E．等位基特异性寡核苷酸杂交
5．RNADNA变性直接点样硝酸纤维素膜基组中特定基表达定性定量研究称：
A．原位杂交 B．斑点杂交 C．Southern杂交
D．Northern杂交 E．Western杂交
6．标记参杂交反应核酸分子称：
A．引物 B．探针 C．dsDNA D．ssDNA E．寡核苷酸分子
7．基芯片技术质：
A．核酸分子杂交技术 B．蛋白质分子杂交技术 C．聚合酶链反应技术
D．基重组技术 E．DNA酶切技术
8．等位基特异寡糖苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时突变探针正常探针接合该样：
A．正常 B．杂合体患者 C．纯合体患 D．携带者 E．确定
9．核酸保持细胞组织切片中适方法处理细胞组织标记核酸探针细胞组织中核酸进行杂交称：
A．原位杂交 B．RNA杂交 C．斑点杂交 D．菌落杂交 E．DNA杂交
10．固定膜DNA片段探针进行杂交前必须膜DNA结合位点全部封闭称：
A．杂交 B．预杂交 C．杂交前处理 D．原位杂交 E．封闭
11．荧光原位杂交：
A．快速确定否存目基 B．检测目标RNA C．基定位分析
D．阳性菌落筛选 E．蛋白水检测
X型选择题
12．标记核酸探针常核素：
A．32P B．3H C．35S D．125I E．14C
13．列探针全程标记方法：
A．缺口移标记法 B．机引物标记法 C．5′末端标记法
D．3′末端标记法 E．PCR标记法
14．影响核酸杂交素：
A．靶DNA分子浓度 B．靶DNA分子长度 C．杂交液组分
D．杂交时间 E．杂交温度
15．基芯片支持介质：
A．硝酸纤维素薄膜 B．玻璃片 C．尼龙膜
D．琼脂糖凝胶 E．聚丙烯酰胺凝胶
16．列作核酸探针：
A．寡核苷酸 B．单链cDNA C．DNA D．RNA E． mRNA
17．关核酸探针描述列正确：
A．DNA B．RNA C．放射性标记
D．非放射性标记 E．必须单链核酸
二思考题
1．简述探针类型制备方法
2．简述常见DNA杂交类型原理
3．简述DNA芯片制备方法
4．简述DNA芯片技术操作流程
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